適于四膜蟲的嗜水氣單胞菌外膜蛋白表達載體的構建及蟲菌共培養(yǎng)的體外試驗.pdf

1、嗜水氣單胞（Aeromonas hydrophila）是人和多種動物的病原菌，其外膜蛋白（outermembrane protein，OMP）具有良好的免疫原性。嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila）是一種營自生的非致病性纖毛蟲，許多研究表明其可作為一個理想的異種表達載體。
　　 按照真核細胞四膜蟲的基因密碼子偏好，優(yōu)化外膜蛋白 A（OmpA）基因密碼子，并化學合成一段抗原性較強的基因片斷，將其克隆至pUC

2、18-T載體，經(jīng)測序確定合成正確。設計一對引物在兩端分別加上EcoR I、XhoI酶切位點，擴增ompA基因，定向克隆至表達質(zhì)粒pET32a（+）中，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性酶切鑒定后測序。結(jié)果表明插入片段長度為219 bp，與合成的序列相比，同源性為99％。將重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ompA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)誘導可表達分子量約30 KD的重組蛋白，用兔抗J-1株總外膜蛋白的血清進行Western blot，在30 KD處有明顯反

3、應條帶，說明所表達的優(yōu)化OmpA保持原有外膜蛋白的反應原性。
　　 根據(jù) neo基因的序列和化學合成的ompd基因序列設計兩對引物，調(diào)整引物中起始密碼子ATG和終止密碼子TGA附近的結(jié)構，分別獲取neo基因和ompd部分基因片斷，再通過重疊延伸的方法，將兩個基因通過一疏水性柔性多肽接頭（Gly4Ser）3堿基序列進行前后拼接，構建新的neo-linker-ompA融合基因。利用嗜熱四膜蟲金屬硫蛋白MTT基因作為啟動子，構建了一個

4、適于嗜熱四膜蟲的基因打靶載體。該載體利用MTT基因的5’側(cè)翼區(qū)作為同源臂，中間嵌入neo-linker-ompA融合基因編碼區(qū)，從而形成了一個表達盒。序列分析表明neo、ompA及接頭拼接組合的順序、方向及序列完全正確。質(zhì)粒的正確構建為下一步在四膜蟲中表達奠定基礎，該載體既滿足在四膜蟲體內(nèi)表達外源蛋白的需要，又具有靶向性，因此具有很強的操作性。
　　 在分別繪制嗜水氣單胞菌J-1株和嗜熱四膜蟲BF-1株生長曲線的基礎上，選擇合適

5、的感染比，探討二者之間的相互作用關系。根據(jù)生長曲線，嗜水氣單胞菌在4h后進入對數(shù)生長期，12 h左右進入穩(wěn)定期，16-17 h達到最高；嗜熱四膜蟲的生長曲線表明，其適宜接種的初始密度為5×103細胞/mL，對數(shù)期10-44 h，穩(wěn)定期44-50 h；將對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的細菌和四膜蟲按照10:1，50:1，100:1的感染比混合，發(fā)現(xiàn)處于對數(shù)生長期的細菌全部被蟲體緩慢消化，穩(wěn)定期的嗜水氣單胞菌以100:1感染比感染蟲體時，可在蟲體內(nèi)增殖