淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PⅠA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及免疫作用研究.pdf

1、淋病(gonorrhea)是由淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，簡稱淋病奈瑟菌)引起的經(jīng)典性病之一。人類是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通過性接觸而傳播。感染淋病奈瑟菌之后，患者發(fā)生泌尿生殖系統(tǒng)的損害，表現(xiàn)為尿道炎和宮頸炎，以及附睪炎、盆腔炎等并發(fā)癥，女性患者還可由于并發(fā)癥造成不育、宮外孕等嚴(yán)重后果。淋病常見，在世界范圍內(nèi)廣為流行；據(jù)近年來世界衛(wèi)生組織估計，全世界每年約有6200萬新病例發(fā)生，其中以歐美和非洲一些國家

2、尤甚。發(fā)病與病人因素，諸如年齡、性別、種族、受教育程度、性行為方式及免疫力有關(guān)，并隨地區(qū)和季節(jié)的不同會有所變化。在美國，淋病發(fā)病率在男性中最高，而在婦女中帶菌最高。美國通過實施淋病控制計劃，已使淋病處于30年來最低水平，遠(yuǎn)低于非淋菌性尿道炎的發(fā)病率。我國解放前淋病流行十分嚴(yán)重，解放初期淋病占第三位。到二十世紀(jì)六十年代中期，淋病基本被消滅。八十年代淋病又重新傳入我國，據(jù)16個城市監(jiān)測，1987年淋病患者為11，115例，1997年發(fā)生淋病

3、224，331例，1999年340，960例，年增長率超過30％，淋病發(fā)病率為20.63/10萬，居性病之首。2000年之后開始下降，淋病患者為285661人，2001年為234，561人，居第二位。 淋病奈瑟菌主要侵犯粘膜，尤其對單層柱狀上皮和移行上皮細(xì)胞有很強(qiáng)的親和力，淋病奈瑟菌侵入前尿道或子宮頸后，借助菌毛、外膜蛋白粘附到柱狀上皮細(xì)胞表面進(jìn)行繁殖，之后被柱狀上皮細(xì)胞吞飲，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致細(xì)胞損傷裂解。淋病奈瑟菌在逸

4、入粘膜下層，通過內(nèi)毒素與補(bǔ)體、IgM等協(xié)同作用，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集吞噬，引起局部急性炎癥，出現(xiàn)充血、水腫、粘膜糜爛和尿痛，形成典型尿道膿性分泌物。當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入尿道腺體和隱窩后，腺管開口及隱窩被阻塞，潛藏的細(xì)菌可引起慢性淋病。近年研究發(fā)現(xiàn)，淋病奈瑟菌外膜蛋白在致病過程及宿主免疫反應(yīng)中起著重要作用，其外膜蛋白至少有3種，分別稱為外膜蛋白Ⅰ(PⅠ)、外膜蛋白Ⅱ(PⅡ)、和外膜蛋白Ⅲ(PⅢ)，其中PⅠ占外膜蛋白的60％以上，在細(xì)胞膜上形成孔道，又

5、稱孔洞蛋白Porin(Por)。淋病奈瑟菌血清學(xué)分型主要有PⅠA和PⅠB，可使水溶性物質(zhì)、對細(xì)菌代謝有重要作用的物質(zhì)及某些抗生素通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。PⅠ作為外膜中的主要成分，因其相對保守的基因序列及相對穩(wěn)定的表達(dá)而受到越來越多的重視，已經(jīng)證實純化的PⅠ在真核細(xì)胞漿膜脂質(zhì)雙分子層中形成電壓依賴式離子選擇通道，這與淋病奈瑟菌的致病密切相關(guān)。PⅠA的粘附功能需要孔洞處于一個開放狀態(tài)，從而提供電壓依賴受體結(jié)合部位和/或有效的嵌入宿主上皮細(xì)胞表

6、面發(fā)揮離子通道的功能。淋病奈瑟菌外膜中大部分的PⅠ以三聚體形式與PⅢ形成復(fù)合物。PⅢ暴露的表面隨著PⅠ表型的變化而變化，因此可以懷疑在PⅠ介導(dǎo)的粘附過程中是否是PⅢ起了實際作用，vanPutten等利用基因敲除(knockout)方法證實，在無PⅢ的情況下真正起粘附作用的仍然是PⅠA。淋病奈瑟菌的致病機(jī)制復(fù)雜，粘附是其致病的先決條件。淋病奈瑟菌入機(jī)體后首先需粘附于泌尿生殖道上皮細(xì)胞表面，然后才能進(jìn)入機(jī)體引起一系列病變。以往只認(rèn)為菌毛是該

7、菌的粘附結(jié)構(gòu)，但近年研究發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白在致病菌粘附過程中也是至關(guān)重要。鑒于該菌的結(jié)構(gòu)特點及致病特點，本研究選用淋病奈瑟菌PⅠA基因作為靶基因，構(gòu)建淋病奈瑟菌真核表達(dá)載體(pCI-PⅠA)，觀察pCI-PⅠA的PⅠA在小鼠肌細(xì)胞漿和膜上的表達(dá)，研究其在動物體內(nèi)中所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，觀察免疫產(chǎn)物體外抗菌效果。 本研究工作分以下二個部分： 一、淋病奈瑟菌真核表達(dá)載體pCI-PⅠA的構(gòu)建、鑒定和體內(nèi)表達(dá) 1、淋病奈瑟菌真核

8、表達(dá)載體pCI-PⅠA的構(gòu)建、鑒定 常規(guī)酚-氯仿法提取淋病奈瑟菌捷克標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA，根據(jù)淋病奈瑟菌外膜蛋白PⅠA基因序列設(shè)計一對攜帶限制性核酸內(nèi)切酶(EcoRⅠ，SalⅠ)位點的引物，采用PCR方法獲得PⅠA全基因片段，產(chǎn)物經(jīng)酚：氯仿：異戊醇抽提后以乙醇沉淀純化；純化產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pCI-neo分別經(jīng)EcoRⅠ，SalⅠ酶切后行凝膠電泳回收目的片段和質(zhì)粒大片段，經(jīng)T4連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)氨芐青霉素抗性、

9、雙酶切和測序篩選出陽性克隆，命名為pCI-PⅠA。 2、淋病奈瑟菌真核表達(dá)載體pCI-PⅠA體內(nèi)表達(dá) 6只Balb/c小鼠分成3組，每組2只，分別注射pCI-PⅠA、空白質(zhì)粒pCI-neo和生理鹽水，100ug/35ul/只，初次免疫后10天同劑量行加強(qiáng)免疫一次。末次免疫4天后處死小鼠，取雙側(cè)股四頭肌作石蠟切片。采用免疫組化方法檢測pCI-PⅠA在小鼠骨骼肌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pCI-PⅠA在小鼠骨骼肌細(xì)胞膜和細(xì)胞漿

10、中均獲得PⅠA的表達(dá)，表明淋病奈瑟菌主要外膜蛋白(PⅠA)真核表達(dá)載體pCI-PⅠA在動物體內(nèi)表達(dá)成功。 二、淋病奈瑟菌真核表達(dá)載體pCI-PⅠA接種、免疫效果的觀察 1、pCI-PⅠA的接種 30只Balb/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，分別注射pCI-PⅠA(100ug/35ul/只)、空白質(zhì)粒pCI-neo(100ug/35ul/只)和生理鹽水(35ul/只)，初次免疫后第3周和第6周各加強(qiáng)免疫一次。分別

11、于第0周(免疫前)、第3、6、8、10、12、16、18周，自小鼠尾靜脈取血，100ul/只，收集血清，第22周白眼眶取血收集血清。采用ELISA方法動態(tài)分析小鼠免疫前后血清特異性IgG抗體水平的變化，以及體外溶菌試驗觀察免疫血清殺菌效果。結(jié)果顯示，血清特異性IgG抗體隨著免疫時間的延長，效價逐漸升高，至第10周達(dá)到最高值(1：4000)，維持到第12周后開始逐漸下降，至第18周降低到最低水平。 2、抗PⅠA抗體體外殺菌效果的觀

12、察 取2張玻片，各滴加免疫血清和生理鹽水，其中生理鹽水為對照組，分別加入活的淋病奈瑟菌，數(shù)分鐘后觀察有無凝集，37℃15min孵育后，繼續(xù)加入新鮮正常小鼠血清(含補(bǔ)體)，再孵育30min，反應(yīng)體系倒入巧克力固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，24～48小時后觀察結(jié)果。與陰性對照比較，菌落數(shù)減少25％即定為殺菌效力為“+”；菌落數(shù)減少25～50％即定為殺菌效力為“++”；菌落數(shù)減少50～75％即定為殺菌效力為“+++”；菌落數(shù)減少75～100％

13、即定為殺菌效力為“++++”；菌落數(shù)減少50％以上為明顯殺菌，即該血清對該淋病奈瑟菌臨床株具有顯著的殺菌作用。 3、T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 18只Balb/c小鼠隨機(jī)平均分成3組，分別注射pCI-PⅠA(100ug/35ul/只)、空白質(zhì)粒pCI-neo(100ug/35ul/只)和生理鹽水(35ul/只)，每周免疫1次，連續(xù)3周，末次免疫7天后，處死小鼠，取脾制備T淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，取100ul

14、細(xì)胞懸液于96孔板中，實驗孔加入10ug純化PⅠA蛋白，對照孔不加PⅠA蛋白，溫箱孵育72小時后，加入MTT，孵育4小時后加入二甲椏砜，測OD57o值，實驗孔OD570值與對照孔OD570值差值代表淋巴細(xì)胞增殖能力。實驗證實pCI-PⅠA免疫組小鼠淋巴細(xì)胞在體外受到PⅠA蛋白再次刺激后出現(xiàn)的明顯的增殖，與空白質(zhì)粒pCI-neo對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，表明pCI-PⅠA能誘導(dǎo)機(jī)體T淋巴細(xì)胞的特異性反應(yīng)。 結(jié)論：淋病