淋病奈瑟菌對頭孢曲松耐藥的分子機制研究.pdf

1、本研究運用次抑菌濃度法在國際上首次成功地體外人工誘導(dǎo)出對頭孢曲松穩(wěn)定的高度耐藥的淋球菌菌株，運用抑制性削減雜交分析誘導(dǎo)耐藥前后淋球菌敏感株和耐藥株之間的耐藥相關(guān)基因并構(gòu)建文庫，運用基因芯片結(jié)合雙色熒光技術(shù)驗證耐藥相關(guān)因并測序，基因序列輸入GenBank行同源性分析，最終確定介導(dǎo)首株耐頭孢曲松淋球菌人工誘導(dǎo)株對頭孢曲松耐藥的基因，闡明首株耐頭孢曲松淋球菌人工誘導(dǎo)株耐藥的分子機制。前瞻性地研究并闡明淋球菌耐頭孢曲松的分子機制，從而制定出防止

2、或延緩其耐藥性產(chǎn)生的措施，對我國乃至全球淋病的預(yù)防和治療將有十分重大的意義。 方法： 1.運用CRO次抑菌濃度法體外人工誘導(dǎo)對CRO敏感的淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226、ATCC43069和臨床株ZSSY00205、ZSSY00206，誘導(dǎo)過程運用生化和分子生物學(xué)試驗監(jiān)測其菌種特性。 2. 運用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)分析淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205誘導(dǎo)前后菌株的基因組DNA差

3、異。 3. 運用產(chǎn)色頭孢菌素法紙片試驗和藥物水解試驗檢測淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226 和臨床株ZSSY00205誘導(dǎo)前后菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶情況。 4.運用紙片擴散法檢測淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205誘導(dǎo)前后菌株對其他抗菌素的耐藥性變化。 5.運用抑制性削減雜交(SSH)構(gòu)建淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205誘導(dǎo)前后菌株的差異基因文庫，并隨機挑取50個克隆行基因測序

4、及功能初篩。 6.運用基因芯片(DNA MicroArray)和雙色熒光技術(shù)驗證淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205誘導(dǎo)前后菌株的差異基因，標(biāo)準(zhǔn)組和臨床組差異基因文庫中分別隨機挑取192個克隆作為探針制作基因芯片，Cy3、Cy5標(biāo)記誘導(dǎo)前敏感株和誘導(dǎo)后耐藥株DNA的RsaI酶切片斷，雜交、洗片后行雙色熒光掃描，挑取紅色熒光克隆20個行基因測序及功能分析。 結(jié)果： 1. 淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49

5、226、ATCC43069對于CRO的MIC值分別達(dá)到0.5μg/ml、0.25μg/ml，臨床株ZSSY00205、ZSSY00206對CRO的MIC值分別達(dá)到32.0μg/ml、16.01.μg/ml，誘導(dǎo)過程中淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226、ATCC43069和臨床株ZSSY00205、ZSSY00206的生物學(xué)鑒定均表現(xiàn)為革蘭陰性雙球菌，氧化酶陽性，糖發(fā)酵見葡萄糖(+)、麥芽糖(-)、蔗糖(-)、乳糖(-)，分子生物學(xué)鑒定均表現(xiàn)

6、為NspA基因陽性。 2. 誘導(dǎo)前后淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205的隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)圖譜無明顯差異。 3.誘導(dǎo)前后的淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205的產(chǎn)色頭孢菌素法紙片試驗均為陰性，藥物水解試驗未見指向氨芐西林(AMP)、頭孢曲松(CRO)藥敏紙片的突出菌苔。 4.誘導(dǎo)后耐CRO的淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株.ZSSY00205較誘導(dǎo)前C

7、RO敏感株對青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星的抑菌環(huán)直徑均有降低。 5.成功地構(gòu)建了淋球菌ATCC49226標(biāo)準(zhǔn)組和ZSSY00205臨床組的差異基因文庫，在ATCC49226標(biāo)準(zhǔn)組篩選出17個功能性差異基因，在ZSSY00205臨床組篩選出22個功能性差異基因。 6.基因芯片結(jié)合雙色熒光技術(shù)確定了包括mtrR、mtrC、gyrB、rpsJ、pJD1在內(nèi)的多個耐藥基因，并發(fā)現(xiàn)2個不能與淋球菌基因組序列相匹配的新基因(分

8、別與腦膜炎萘瑟菌血清型A、霍亂弧菌l型生物變種有較大的同源性)。 結(jié)論： 1.CRO次抑菌濃度法可誘導(dǎo)CRO敏感的淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226、ATCC43069和臨床株ZSSY00205、ZSSY00206成為穩(wěn)定的高度耐CRO菌株，雖歷經(jīng)漫長的誘導(dǎo)過程，各菌株的種屬特性未發(fā)生改變。 2.誘導(dǎo)前后淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205的基因組DNA未發(fā)生較大的改變。 3.誘導(dǎo)前后的淋

9、球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205既不表達(dá)青霉素酶，也不表達(dá)ESBL或AmpC酶。 4.淋球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC49226和臨床株ZSSY00205對CRO耐藥的同時均伴有對青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、環(huán)丙沙星等抗菌素耐藥性的增加，提示多重耐藥，可能與染色體介導(dǎo)的多基因突變有關(guān)。 5.綜合抑制性消減雜交(SSH)初篩結(jié)果和基因芯片(DNAMicroArray)驗證結(jié)果分析，淋球菌對CRO的耐藥機制主要與mt