耐藥嗜水氣單胞菌的外膜結(jié)構(gòu)和免疫原性變化的初步研究.pdf

1、本研究從自然條件下發(fā)病的瀕死魚體內(nèi)分離篩選到6株對(duì)四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物敏感的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，采用次抑菌濃度傳代培養(yǎng)方法，人工誘導(dǎo)分別得到耐鹽酸四環(huán)素、耐鹽酸多西環(huán)素、耐諾氟沙星和耐左氧氟沙星的A． hydrophila菌株，分析敏感和耐藥A. hydrophila外膜中主要保護(hù)性抗原脂多糖和外膜蛋白的SDS-PAGE電泳條帶差異，初步探討了A． hydrophila耐四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物

2、的多重耐藥機(jī)制。制備敏感菌和人工誘導(dǎo)獲得的耐藥突變A. hydrophila的外膜蛋白、脂多糖和福爾馬林滅活全菌疫苗，分別腹腔注射免疫接種斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus Rafinsque），探討敏感菌和耐藥菌苗的免疫效果差異，初步闡明了A． hydrophila耐藥性變化和抗原性變化的關(guān)系，為耐藥菌的成分疫苗及防治藥物研究奠定理論基礎(chǔ)，為耐藥菌的防治提供新的思路。研究結(jié)果如下：
　　 1．獲得6株致病性的A

3、. hydrophila。其編號(hào)分別為Ah638、Ah640、Ah563、Ah541、Ah15和Ah28。參照依日本化學(xué)療法學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定試驗(yàn)藥物對(duì)菌株的最小抑菌濃度(MIC)，并查找MIC解釋標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明除了Ah563、Ah638、Ah28和Ah15對(duì)鹽酸四環(huán)素為中介菌外，6株A. hydrophila菌株對(duì)鹽酸多西環(huán)素、諾氟沙星和左氧氟沙星均敏感，Ah541和Ah640對(duì)鹽酸四環(huán)素也敏感，同時(shí)氟喹諾酮類藥物的抑菌效果比四環(huán)素

4、類藥物強(qiáng)，尤其是左氧氟沙星的抑菌能力特別強(qiáng)。
　　 2．在28℃條件下培養(yǎng)72h為1代，分別在含有鹽酸多西環(huán)素、鹽酸四環(huán)素、諾氟沙星和左氧氟沙星的藥物培養(yǎng)基中連續(xù)傳代9次后，四環(huán)素類對(duì)3個(gè)菌株的MIC上升倍數(shù)為8～32倍，氟喹諾酮類藥物組MIC上升倍數(shù)為125～7997倍，且耐藥獲得后保持穩(wěn)定。同時(shí)A.hydrophila對(duì)四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物存在交叉耐藥。耐藥菌4℃保存10d和20d耐藥性保持穩(wěn)定，30d耐藥性均有不同程度

5、的下降。
　　 3．通過比較敏感菌與耐藥菌外膜蛋白和脂多糖的SDS-PAGE電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)所有耐藥A． hydrophila的外膜蛋白片段均發(fā)生改變，不同菌株改變情況略微不同。和敏感菌相比，耐藥菌有的外膜蛋白條帶(42.6kD)表達(dá)上升，有的外膜蛋白條帶表達(dá)減少（36.6kD、27.7kD和22.2kD）。研究發(fā)現(xiàn)耐藥A． hydrophila的脂多糖電泳圖譜均顯示快速遷移條帶表達(dá)密度降低，耐藥性上升倍數(shù)更大的左氧氟沙星耐藥菌則

6、顯示快速遷移條帶遷移表達(dá)密度降低更多，蛋白酶K消化組顯示條帶密度更低，高水平耐藥的諾氟沙星耐藥菌（MIC200μg/mL）的脂多糖快速遷移條帶遷移的更遠(yuǎn)。
　　 4．斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus Rafinsque)經(jīng)腹腔注射免疫接種諾氟沙星敏感菌和人工誘導(dǎo)耐藥菌的3種疫苗后，均能產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，所有受免魚血清凝集抗體效價(jià)和交叉凝集抗體效價(jià)、溶菌酶活性、血液吞噬細(xì)胞的吞噬活性均顯著高于無菌生理鹽水對(duì)照組