鯉嗜水氣單胞菌弱毒株篩選及免疫原性評價(jià).pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，可以引起鯉（Cyprinuscarpio）、鯽（Carassius aumtus）等多種淡水養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性敗血癥的爆發(fā)，對漁業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國主要使用化學(xué)藥物對魚病進(jìn)行防控，大量化學(xué)藥物的使用會導(dǎo)致藥物殘留，破壞生態(tài)環(huán)境，并且為超級細(xì)菌的產(chǎn)生創(chuàng)造條件，所以使用疫苗對魚病進(jìn)行免疫防控是未來的發(fā)展趨勢。然而我國尚未普及以疫苗為主的魚病防控方法。原

2、因主要有兩方面:首先由于現(xiàn)階段研制的魚用疫苗免疫效果不穩(wěn)定;另一方面疫苗導(dǎo)入方法不夠高效，難以滿足生產(chǎn)需求。所以，研發(fā)高效穩(wěn)定，操作簡便的魚用疫苗是現(xiàn)階段魚類疾病防控研究的重點(diǎn)。本論文針對由嗜水氣單胞菌引起的傳染性疾病，開展了鯉嗜水氣單胞菌弱毒疫苗的研制及不同導(dǎo)入途徑的疫苗免疫效果評價(jià)。旨在找到一種可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，高效穩(wěn)定、操作簡便的嗜水氣單胞菌弱毒疫苗，預(yù)防由嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥，并為魚用疫苗免疫效果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立提

3、供參考。本論文主要內(nèi)容如下:
　　1.利福平篩選嗜水氣單胞菌弱毒菌株
　　以采自新鄉(xiāng)本地的高致病性鯉嗜水氣單胞菌菌株XX1為研究對象，通過利福平梯度濃度篩選，獲得一株毒性明顯降低，以正常攻毒劑量未導(dǎo)致鯉發(fā)病的弱毒菌株，命名為XX1LA菌株。經(jīng)測定，XX1LA的半數(shù)致死量(LD50)為4.5×109 CFU/ml是XX1半數(shù)致死量的200倍。用100μl濃度為106 CFU/ml的XX1LA進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，鯉并未出現(xiàn)嗜水氣單胞菌

4、感染癥狀及死亡現(xiàn)象，體外連續(xù)培養(yǎng)及體內(nèi)多次攻毒和回收實(shí)驗(yàn)過程中，XX1LA毒性無復(fù)壯現(xiàn)象，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)利福平篩選獲得的嗜水氣單胞菌弱毒菌株XX1LA具有毒性大幅減弱、無致病性及穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，可以作為制備嗜水氣單胞菌弱毒疫苗的候選菌株。
　　2.嗜水氣單胞菌弱毒疫苗XX1LA免疫效果評價(jià)
　　本論文采用相對免疫保護(hù)率(RPS)、血清特異性抗體效價(jià)、血清溶菌酶活性和免疫相關(guān)基因表達(dá)水平等指標(biāo)，對XX1L

5、A的免疫效果進(jìn)行評價(jià)，并與傳統(tǒng)的福爾馬林滅活嗜水氣單胞菌疫苗的免疫效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示:免疫14d后XX1LA組的相對免疫保護(hù)率(83.7％)顯著高于滅活疫苗組(37.2％)(P＜0.05);XX1LA和滅活疫苗組血清特異性抗體效價(jià)在免疫28 d內(nèi)逐漸升高，并在免疫14d后顯著高于對照組，XX1LA組在免疫28 d后，血清特異性抗體效價(jià)與滅活疫苗組和對照組間均存在顯著性差異（P＜0.05）;;免疫相關(guān)基因IL-1β、IL-10和IgM

6、在肝臟和脾臟中的表達(dá)量在免疫后均有上調(diào);但是，對于血清中溶菌酶活性而言，實(shí)驗(yàn)組與對照組之間無顯著性差異。研究結(jié)果表明，XX1LA對鯉呈現(xiàn)出較好的免疫保護(hù)效果。
　　3.不同方法導(dǎo)入弱毒疫苗XX1LA的免疫效果比較
　　本論文采用浸泡和腹腔注射兩種方法，導(dǎo)入嗜水氣單胞菌弱毒疫苗XX1LA。分別從血清溶菌酶活性，血清特異性抗體凝集效價(jià)和相對免疫保護(hù)率三個(gè)方面評價(jià)兩種導(dǎo)入方法的免疫效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清溶菌酶活性在疫苗導(dǎo)入后7d

7、和14d時(shí)，浸泡組和注射組顯著高于對照組（P＜0.05）;血清特異性抗體凝集效價(jià)在免疫后14-28 d，浸泡組和注射組均顯著高于對照組(P＜0.05)，浸泡組與注射組之間無顯著性差異;注射組和浸泡組的相對免疫保護(hù)率分別達(dá)到78.85％和80.77％，兩種疫苗導(dǎo)入方法均呈現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弱毒疫苗XX1LA采用浸泡法導(dǎo)入鯉魚種后，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性免疫應(yīng)答，能夠有效防控由嗜水氣單胞菌引發(fā)的細(xì)菌性敗血癥，免