IBDV強(qiáng)、弱毒株病毒樣顆粒免疫原性的比較及噬菌體抗IBDV抗體文庫的構(gòu)建.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性、致死性疾病，主要攻擊禽類重要的中樞免疫器官法氏囊，能夠引起免疫抑制進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)感染，最終造成雞的死亡，危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。疫苗是防控該病的有效方法，傳統(tǒng)的疫苗存在一些難以避免的缺點，弱毒苗的廣泛使用易導(dǎo)致毒株突變，而強(qiáng)毒滅活苗存在滅活不徹底等生物安全隱患。近年興起的病毒樣顆粒(VLP)等亞單位疫苗能克服上述缺

2、點，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。目前很多雞場也采用卵黃抗體緊急治療IBD發(fā)病雞群，在一定程度上降低了經(jīng)濟(jì)損失。卵黃抗體雖然制備方式簡單，但是具有純度差和抗體滴度低等缺點，采用基因工程方法制備高純度的治療性抗體是病毒性疾病治療的發(fā)展趨勢。
　　VP2是IBDV唯一的衣殼蛋白，位于病毒衣殼的外部，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，決定IBDV的抗原性，是制備VLP疫苗的重要靶標(biāo)。然而IBDV強(qiáng)、弱毒VP2誘導(dǎo)免疫反應(yīng)存在差異，為篩選更有效的I

3、BDV VLP候選疫苗，本研究在IBDV超強(qiáng)毒株Gx株VLP制備的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增IBDV人工致弱毒株Gt株的VP2基因序列，將其克隆在酵母表達(dá)載體pAO815上構(gòu)建成pAO815-NHisGtVP2質(zhì)粒，將其電轉(zhuǎn)至酵母菌株SMD1168后，經(jīng)過5天的誘導(dǎo)表達(dá)，成功表達(dá)了Gt VP2蛋白。通過疏水層析純化的萬法制備了純度高的弱毒VLP，建立了更高效的VLP制備方法。瓊脂擴(kuò)散試驗結(jié)果表明制備的Gt VLP具有良好的抗原性。將Gx和Gt VLP

4、免疫SPF雞，比較評價了二者對IBDV超強(qiáng)毒的免疫保護(hù)效果。強(qiáng)、弱毒VLP免疫組血清中和抗體滴度在免疫5周內(nèi)始終維持在較高的水平，表明二者均能誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)的免疫反應(yīng)。強(qiáng)毒VLP免疫組能夠產(chǎn)生100％的攻毒保護(hù)率，攻毒后法氏囊狀態(tài)良好。而弱毒VLP免疫組能夠產(chǎn)生80％的攻毒保護(hù)率，攻毒后雞的法氏囊萎縮明顯。這些結(jié)果表明，免疫強(qiáng)毒VLP比免疫弱毒VLP對雞群抵抗IBDV超強(qiáng)毒株具有更好的保護(hù)效果。
　　噬菌體展示技術(shù)是篩選抗體的有效技

5、術(shù)手段，為了篩選有效的IBD治療性抗體，本研究從免疫過Gx VLP的雞全血中分離外周血淋巴細(xì)胞，從中擴(kuò)增出抗體的輕鏈可變區(qū)(VL區(qū))與重鏈可變區(qū)(VH區(qū))，通過柔性Linker將二者連接。將其克隆進(jìn)噬菌粒構(gòu)建了pCANTAB5E-scFv質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化之后建立了雞源噬菌體抗IBDV抗體文庫。通過三輪的淘選富集以及ELISA鑒定，最終測序得到了5株陽性抗體序列。表達(dá)純化后的單鏈抗體的中和活性有待進(jìn)一步驗證。
　　本研究比較了強(qiáng)、弱毒病毒