IBDV致病性與VP5基因關系及GX8-99株細胞克隆化毒株免疫原性的研究.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)引起雞的急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的中樞免疫器官一法氏囊，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。該病毒導致免疫抑制，造成對其他疫病的易感性增強和降低對其它疫苗的反應性。近年來，IBDV在分子水平對IBDV的免疫機理、致病機制、病毒分子的結構與功能方面取得很大的進展，但是仍

2、有許多地方有待于進一步研究，特別是變異株、vvIBDV的出現(xiàn)，抗原的變異和多樣性、血清亞型，使本病的防治和臨床診斷困難，對養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重損失。
　　 IBDV為雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，利用當?shù)胤蛛x的變異株或選用抗原性與當?shù)刈儺愔杲咏囊呙缰曛瞥蓽缁蠲缁蛉醵久?，以及利用多種毒株聯(lián)合制成多價疫苗，可以使雞群得到很好的免疫保護。我們在實施國家自然基金重大項目過程中，感染vvIBDVGX8/99株的雞的發(fā)病率和死亡率比較高，雞場

3、出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象頻繁發(fā)生。本課題擬以vvIBDVGX8/99株為研究對象，將vvIBDVGX8/99株進行傳代，研究從原始毒(雞源毒)→雞胚毒→細胞適應毒→細胞克隆化毒→克隆化毒株的細胞傳代至30代的致病性，免疫原性的變化規(guī)律及其與核苷酸、氨基酸之間的關系。更好地掌握vvIBDV在整個傳代致弱的過程中的免疫原性變化特點、vvIBDV“個體效應”的變化規(guī)律，同時進行不同免疫佐劑對四株克隆化毒株免疫效果影響的試驗以探尋更好的佐劑和疫苗組合

4、，為我國vvIBDV分子流行病學的研究及IBD的有效防治奠定基礎。揭示超強毒的演變規(guī)律和毒力改變的分子基礎，為解決超強毒毒力增強、超強毒能否致弱以及致弱過程中基因序列和核苷酸序列的變化，這種變化與病毒生物學特性的關系，弱毒株的生物學特性如何等急需解決的問題提供依據(jù)。
　　 1.超強毒IBDVGX8/99株不同傳代毒致病性與VP5基因的關系分析
　　 本研究將vvIBDVGX-8/99株原代毒、雞胚毒、克隆化毒、回傳SPF

5、雞10代次毒及克隆化細胞傳代20代次毒分別測定ELD50,以相同的ELD50病毒量分別接種SPF雞，從而觀察vvIBDVGX-8/99株在傳代過程中致病性的變化規(guī)律。同時分別提取病毒RNA，通過RT-PCR、PCR擴增、基因克隆、核苷酸序列測定和分析，對IBDVGX8/99株的24株不同傳代毒的VP5基因進行比較，發(fā)現(xiàn)其同源性在94％-100%之間。并且有15個易發(fā)生變異的位點，其中位點bp#2、#8、#52、#145、#232、#27

6、2、#310、#364、#385、#409的堿基變異引起了相應氨基酸的改變，而位點bp#18、#285、#331、#354、#397的堿基變異沒有引起相應氨基酸的變化。通過比較分析，可以看到在致死率由原代毒的86.7％降為GXE10的43％時，VP5基因的核苷酸有四個位點發(fā)生了變異，致死率由GXE10的43％降為GXC23的3.3％H寸，VP5基因的核苷酸有10個位點發(fā)生了變異；而將GXC23克隆化后的4株毒株致病性變化不大，并且僅在G

7、XC11-1的#8位點，GXCl2-1和GXCl4-1的#364位點發(fā)生變異；將4株克隆化毒株回傳SPF雞10代后的致死率有一定程度的回升，且有兩個位點發(fā)生變異；4株克隆化毒株在細胞上連續(xù)傳20代后其致死率都降為0,并且克降株5沒有發(fā)生核苷酸變異，而克隆株1、2、4也僅有一個核苷酸位點發(fā)生變異。由此推論vvIBDV的致病性與VP5某些氨基酸的變異有一定的關系，更可能與病毒對細胞的親嗜性關系密切，這為探明超強毒法氏囊病毒毒力改變的分子基礎

8、，從而解釋自然界中vvIBDV出現(xiàn)的原因和致弱的原因提供了佐證。
　　 2.vvIBDVGX8/99克隆化毒株細胞致弱毒VP5基因原核表達系統(tǒng)的建立
　　 本研究以vvIBDVGX8/99株4株克隆化細胞毒GXCL1、GXCL2、GXCL4、GXCL5為研究對象，將4株已在CEF上連續(xù)傳20代的克隆化細胞毒通過雞胚成纖維細胞再傳10代，對各克隆化毒每隔四代毒株的VP5基因進行測序。根據(jù)兩部分的測序結果，從中選取3株氨基酸

9、序列差異較大的毒株(GXC11-1、GXC12-10、GXC14-25)的VP5基因作為本部分的研究內容。應用RT-PCR技術從上述3毒株中擴增得到VP5基因，并將其克隆到原核表達載體pET32a中，構建了重組原核表達質粒pET32a-VP5，對重組表達質粒鑒定正確后，轉化大腸埃希菌Rosetta進行誘導表達，SDS-PAGE和Westernblot檢測結果表明，IBDV-VP5基因在大腸埃希菌Rosetta中得到了正確表達，所表達的融

10、合蛋白與IBDV陽性血清具有特異性抗原抗體反應。
　　 3.泰山松花粉多糖對4株IBDV克隆化毒株免疫增強效果的影響
　　 根據(jù)第二部分的研究選取4株氨基酸序列差異顯著的克隆化毒株GXCL1-25、GXCL2-30、GXCL4-25、GXCL5-30,并采用泰山松花粉多糖為免疫佐劑(蜂膠佐劑作為對照)，對其免疫效果進行分析。將4株細胞毒測TCID50統(tǒng)一定量后，每一毒株分別設置無免疫佐劑(1、4、7、10)，松花粉多糖佐

11、劑(2、5、8、11)，蜂膠佐劑(3、6、9、12)三個平行試驗組，并設一組生理鹽水空白對照組(13)。免疫SPF雞，14日齡首免，25日齡進行二免。分別于一免疫后0、3、7d，二免后3、10、17、24d采血，用ELISA方法檢測血清抗體效價和IL-2水平，全自動血細胞分析儀測定28與42日齡的外周血淋巴細胞比率，于28、42日齡每組剖殺5只測免疫器官指數(shù)，35日齡進行攻毒試驗。對各試驗組試驗結果進行分析可發(fā)現(xiàn)二免后第10d左右抗體和