胸膜肺炎放線桿菌生物被膜突變體的篩選與生物學(xué)特性的研究.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是豬傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）的病原菌，引起豬的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。APP是豬呼吸道的專性寄生菌，通過空氣和直接接觸來傳播。由于APP血清型眾多，各血清型之間交叉保護(hù)力較低，傳統(tǒng)的滅活疫苗和亞單位疫苗的效果均不理想。因此，迫切需要更安全、高

2、效的新型疫苗來預(yù)防和控制該傳染病的發(fā)生與流行。
　　 毒力因子的全面鑒定是病原菌致病機(jī)理研究和防治產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)。信號標(biāo)簽誘變（signature-tagged mutagenesis，STM）是一種經(jīng)過優(yōu)化的經(jīng)典的轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)，可以用含多個序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座子構(gòu)建病原菌的突變體庫，通過宿主或?qū)嶒?yàn)動物來負(fù)向篩選致弱突變體，進(jìn)而鑒定相關(guān)基因。自1995年首次建立以來，STM技術(shù)被廣泛用于多種病原菌毒力相關(guān)基因的發(fā)掘與鑒定。
　

3、　 很多病原菌為了適應(yīng)體內(nèi)外的環(huán)境會形成生物被膜（biofilm）。大量的研究表明，生物被膜的形成與病原菌的免疫逃避和抗藥性有關(guān)，是影響感染的重要因素。本研究構(gòu)建了APP血清1型的STM突變體庫，從中篩選到2個生物被膜形成突變菌株，對突變基因進(jìn)行了定位和克隆，對突變菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為闡明APP生物被膜的形成機(jī)制提供了一定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 1．APP血清1型STM突變體庫的構(gòu)建
　　 以APP血清1型萘啶酸

4、抗性菌株4074-N為受體菌，以攜帶mini-Tn10的標(biāo)簽質(zhì)粒（pLOF/TAG1-48）的E．coli CC118λ pir或Sm17-1λ pir為供體菌，在或不在E．coli DH5α（pRK2073）的輔助下，進(jìn)行三親本或兩親本接合，通過轉(zhuǎn)座子內(nèi)攜帶的卡那霉素抗性篩選、氨芐青霉素負(fù)篩選、PCR和Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)座突變株。在APP與E．coli接合實(shí)驗(yàn)中，通過對兩親本接合與三親本接合進(jìn)行了比較，證明了兩親本接合的效率明

5、顯高于三親本接合。用兩親本接合方法，構(gòu)建了32個STM標(biāo)簽的APP突變體庫，共得到1652個轉(zhuǎn)座突變菌株（每個標(biāo)簽不少于50個突變體）。
　　 2．APP生物被膜形成突變體的篩選及插入失活基因的鑒定
　　 用96孔板法和試管法從上述APP血清1型4074-N株（不產(chǎn)生生物被膜）STM突變體庫中篩選到兩株能產(chǎn)生很強(qiáng)生物被膜的突變體，即STM1-21和STM6-42。提取突變體的基因組用轉(zhuǎn)座子內(nèi)的SspⅠ酶切后進(jìn)行自連接。以

6、連接產(chǎn)物為模板，用轉(zhuǎn)座子上的特異性引物STM10/11和STM10/12，通過反向PCR擴(kuò)增，獲得轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)兩側(cè)的基因片段。經(jīng)DNA測序和BLAST分析，發(fā)現(xiàn)這兩株突變體均為Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子插入失活編碼一種類組氨酸核結(jié)構(gòu)蛋白（Histone-like nucleoid structuring protein）的hns基因造成的。PCR和Southern雜交進(jìn)一步確定了插入突變體的正確性。
　　 3．APP H-NS的

7、結(jié)構(gòu)與功能的初步研究
　　 APP的hns基因編碼一種135個氨基酸的類核結(jié)構(gòu)蛋白H-NS，主要由三個結(jié)構(gòu)域組成，即N端的聚合結(jié)構(gòu)域、C端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和中間的柔性連接片段。通過N端的聚合結(jié)構(gòu)域形成多聚體結(jié)構(gòu)，C端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶基因結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用。
　　 為了研究APP的hns基因的功能，將4074-N株的hns基因表達(dá)盒（包括其編碼區(qū)、啟動子和終止子序列）克隆到能穿梭質(zhì)粒pJN105中，構(gòu)建了一個重組表

8、達(dá)質(zhì)粒pJN-hns，分別電轉(zhuǎn)化到hns轉(zhuǎn)座突變菌株STM1-21（M）和親本菌株4074-N（P）中，期望獲得互補(bǔ)菌株（C-3）和過表達(dá)菌株（O-2）；然后比較分析了上述四個菌株P(guān)、M、C-3和O-2的生長特性、生物被膜形成和毒力的變化，結(jié)果表明：4個菌株的體外生長速度未見明顯差異；除突變菌株M外，其它3個菌株均不能形成可測的生物被膜；菌株M、C-3和O-2對小鼠的毒力和溶血活性均有不同程度的減弱。互補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株的上述表型均與預(yù)

9、期的結(jié)果不一致。為了進(jìn)一步解釋這種現(xiàn)象，我們通過實(shí)時熒光定量RT-PCR分析了上述4個菌株中hns基因及兩種重要毒力基因axpⅠA和axpⅡA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，hns基因在C-3和O-2菌株中均有表達(dá)，但表達(dá)量均比親本菌株P(guān)還要低，提示H-NS的缺失在C-3株中并沒有得到有效互補(bǔ)，H-NS也沒有在O-2株中過表達(dá)，C-3和O-2均表現(xiàn)為hns的下調(diào)表達(dá)菌株，這可能是因?yàn)閔ns基因的表達(dá)存在自調(diào)控機(jī)制，這種表達(dá)自調(diào)控機(jī)制在大腸桿菌中已

10、有報道。此外，axpⅠA和axpⅡA的表達(dá)下調(diào)也初步解釋了菌株M、C-3和O-2的毒力與溶血活性減弱現(xiàn)象。為了進(jìn)一步研究H-NS蛋白對APP生物被膜形成的影響，本實(shí)驗(yàn)以APP血清1型4074株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增了408 bp的hns基因編碼區(qū)，克隆到原核表達(dá)載體pET-28c中獲得重組質(zhì)粒pET28c-hns，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和組氨酸親和層析柱純化獲得大小

11、約19 kD的重組蛋白rH-NS。將不同濃度的rH-NS添加到hns突變株1-21及其親本菌株4074的培養(yǎng)基中，用微孔板法測定生物被膜的形成。結(jié)果顯示，在不添加rH-NS時，4074株不能形成可見的生物被膜，而1-21株形成明顯的生物被膜；在添加0.1～0.3μmol/L的rH-NS的情況下，1-21株生物被膜的形成量隨著rH-NS濃度的升高而降低，而4074株隨著rH-NS濃度的升高而升高；rH-NS添加量超過0.4μmol/L對兩