基于磁珠—酶放大免疫熒光方法檢測豬胸膜肺炎放線桿菌感染血清中ApxIVA抗體.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious pleuropneumonia)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的，屬于豬三大呼吸道傳染病之一，在世界絕大部分國家和地區(qū)均有爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。豬場一旦感染該病其急性致死率高達80%以上，而轉(zhuǎn)變成慢性感染后會嚴重影響豬的生長，且存活下來的豬會成為病原攜帶者，在適當?shù)臈l件下將能使該病再次爆發(fā)。因此，為

2、了有效的防疫和控制該疾病的爆發(fā)，對該病的檢測，特別是早期診斷具有重要的意義。目前，使用最為廣泛的診斷手段是利用間接ELISA技術(shù)對APP感染豬血清中的抗體進行檢測。雖然該方法具有易于操作、特異性好等優(yōu)勢，但是其靈敏度低、耗時長等不足嚴重制約了其在臨床上的應(yīng)用。所以，建立新型的快速、高靈敏度的檢測方法具有現(xiàn)實意義。
　　 磁性微粒，簡稱磁珠自上世紀70年代以來得到了廣泛的研究，因為其具有粒徑小(10 nm-100μm)、比表面積大

3、、生物親和性好以及超順磁性和分散性好等特點而被作為一種有效的固相載體用在免疫診斷、生物分子純化和細胞分離等生物領(lǐng)域中。用于免疫診斷中，因為磁珠捕獲抗體(抗原)分子能力強，且在三維空間進行免疫反應(yīng)，所以利用磁珠作為載體進行疾病的免疫檢測具有靈敏度好、檢測時間快、易于操作和檢測成本低等特點使其具有巨大的應(yīng)用價值而得到研究者的重視。
　　 本實驗以磁珠為固相載體，以大腸桿菌原核重組表達的APP特異性的外毒素蛋白ApxIVA作為抗原，構(gòu)

4、建了一種簡單、低成本且易于操作的基于磁珠-酶放大的熒光免疫方法檢測APP感染血清中的ApxIVA抗體。其具體方法為：首先將ApxIVA抗原蛋白固定在磁珠表面，依次加入感染血清進行第一次免疫反應(yīng)，加入酶標二抗進行第二次免疫反應(yīng)。HRP可以催化底物對羥基苯乙酸產(chǎn)生具有熒光信號的聯(lián)苯乙酸，而感染APP血清中的ApxIVA抗體就可以通過測定聯(lián)苯乙酸的強度而進行檢測。在最優(yōu)的實驗條件下，我們得到了很好的線性，即在160-5120倍稀釋的標準陽性范

5、圍內(nèi)成線性。該方法的檢測線是10240倍稀釋血清，遠遠低于傳統(tǒng)的ApxIVA-ELISA方法的檢測線(320倍)(S/N=3)。同時，我們測定了11組320倍稀釋的標準陽性血清，計算它們的相對標準偏差為4.8%。這說明我們提供的方法具有很好的重復(fù)性。同時，與商用ApxIVA-ELISA試劑盒共同分析了78份臨床豬血清，其結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)兩種方法具有89.7%的符合率、90.9%的敏感性和89.3%的特異性。這說明我們構(gòu)建的方法具有應(yīng)用于臨床