胸膜肺炎放線桿菌毒素蛋白的克隆表達(dá)及多重?zé)晒釶CR診斷方法的研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一種豬的高度接觸性傳染病，針對(duì)胸膜肺炎放線桿菌血清型眾多，現(xiàn)有疫苗缺乏交叉保護(hù)力，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的現(xiàn)狀，研究開(kāi)發(fā)具有交叉保護(hù)力的新型疫苗迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn)Apx毒素是APP的主要保護(hù)性抗原，可提高疫苗滅活疫苗的保護(hù)作用。天然毒素

2、提取產(chǎn)量低、過(guò)程繁瑣且成本較高，利用體外克隆表達(dá)編碼Apx毒素結(jié)構(gòu)蛋白的基因，獲得的重組蛋白與天然提取的毒素免疫原性無(wú)明顯差異，可為下一步新型疫苗多肽成分和ELISA診斷抗原的研究做充分準(zhǔn)備。apxIV是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有APP種屬特異性的抗原，只存在于自然感染的動(dòng)物體內(nèi)，不會(huì)與其它放線桿菌和革蘭氏陰性桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)。編碼ApxⅣ毒素結(jié)構(gòu)蛋白的apxⅣA基因C端特異性和保守性均很強(qiáng)，是首選的診斷抗原和靶基因。 本研究運(yùn)用蛋白

3、質(zhì)軟件Anthe 5.0分析了APP的兩個(gè)關(guān)鍵毒力因子ApxⅠA和ApxⅡA的抗原性和親水性，截取其中主要抗原位點(diǎn)相對(duì)集中的核心區(qū)域，分別從胸膜肺炎放線桿菌血清1型國(guó)內(nèi)參考株259和血清7型國(guó)內(nèi)參考株265中擴(kuò)增了apxⅠA和apxⅡA毒素基因，進(jìn)行體外克隆，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/apxⅠA和pET32a/apxⅡA以及真核表達(dá)載體pPICZaA/apxⅠA；并用T4連接酶串連apxⅠA和apxⅡA基因，構(gòu)建了該融合基因

4、的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/apxⅠA-apxⅡA；從胸膜肺炎放線桿菌血清1型國(guó)內(nèi)參考株259中擴(kuò)增apxⅣA毒素C端特異和保守的一段基因，進(jìn)行體外克隆，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/apxⅣA。 以上四個(gè)原核表達(dá)載體分別在大腸桿菌DH5a、BL21和。Top10'F中以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅠA-ApxⅡA及ApxⅣA在大腸桿菌中均以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)的重組融合蛋白分別占菌體總蛋白

5、的32％、23％、19％和40％，利用溶菌酶和超聲波對(duì)重組菌進(jìn)行分次裂解，除去大部分可溶的菌體蛋白，再用Glutathione Sepharose 4B或Ni-NTA對(duì)相應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)柱純化，最終獲得的重組融合蛋白純度在92％9～8％之間，Westem-blot的結(jié)果表明以上蛋白均具有良好的反應(yīng)原性，可直接用于ELISA診斷抗原或新型疫苗多肽成分的研究。 ApxlA的真核表達(dá)載體經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，在畢赤酵母GS115中以低水平分泌

6、表達(dá)至培養(yǎng)液上清，經(jīng)40倍濃縮才能檢測(cè)到目的蛋白，同時(shí)從重組酵母總RNA中檢測(cè)到apxⅠA基因的mRNA，可以證實(shí)目的基因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄。經(jīng)分析，造成apxⅠA基因在畢赤酵母系統(tǒng)中低水平表達(dá)的原因可能是：一、組成目的基因的密碼子對(duì)于畢赤酵母的偏好指數(shù)極低；二、大量的酵母稀有密碼子使得目的基因中tRNA豐度較低，導(dǎo)致翻譯過(guò)程出現(xiàn)瓶頸效應(yīng)；三、目的基因的高AT含量使酵母表達(dá)的轉(zhuǎn)錄提前終止。 豬傳染性胸膜肺炎和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型在臨床上共感染

7、較為普遍，都以侵害呼吸系統(tǒng)為主，根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌apxⅣA基因和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF2基因中最特異最保守的片段分別設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記TaqMan探針，建立了可同時(shí)鑒別診斷豬傳染性胸膜肺炎和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法，與其它經(jīng)常發(fā)生混合感染的豬繁殖呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(HCV)、偽狂犬病毒(PRV)、副豬嗜血桿菌(HP)、多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌等病原體均無(wú)交叉反應(yīng)。該方法用于檢測(cè)APP和PC