多重?zé)晒釶CR檢測(cè)產(chǎn)vero毒素大腸桿菌（VTEC）方法的研究及初步應(yīng)用.pdf

1、產(chǎn)Vero毒素大腸埃希氏菌(Vcrocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC)，又稱產(chǎn)類志賀氏菌毒素大腸桿菌(Shiga-like toxin-producingEscherichia coli，SLTEC)，是指能夠產(chǎn)生對(duì)Vero細(xì)胞和Hela細(xì)胞有毒性的VT1、VT2及VT1、VT2變異毒素的一群大腸埃希氏菌。 該類菌主要通過食物傳播，動(dòng)物產(chǎn)品有可能是感染人類的主要來源。能引起任何動(dòng)

2、物的溶血性尿毒綜合癥(HUS)、出血性結(jié)腸炎(HC)和血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等嚴(yán)重疾病。目前世界上許多發(fā)達(dá)國家和一部分發(fā)展中國家都發(fā)生過VTEC的暴發(fā)流行，成為全球性的公共衛(wèi)生問題。新加坡官方已明確要求，所有對(duì)新進(jìn)口的肉食品必須檢測(cè)VTEC，因此建立快速準(zhǔn)確的診斷方法已成為動(dòng)物產(chǎn)品檢疫的迫切要求。 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是一種新型的核酸檢測(cè)技術(shù)，在臨床診斷中已經(jīng)用于細(xì)菌、病毒及遺傳性疾病的檢測(cè)，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。本研究中

3、依據(jù)SYBR Green I能和雙鏈DNA結(jié)合的特性，根據(jù)VT1和VT2毒素基因的保守性分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行多重?zé)晒釶CR反應(yīng)，從而為出口肉食品檢測(cè)和臨床診斷提供有力的依據(jù)。本課題分兩部分進(jìn)行研究。 試驗(yàn)一產(chǎn)vero毒素大腸桿菌(VTEC)多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的建立該研究的目的是通過比較Genbank中已發(fā)表的VT基因序列的同源性，設(shè)計(jì)特異性引物，利用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有以VTEC的DNA為模板可以擴(kuò)增出95bp和

4、108bp的特異條帶。利用SYBR Green I能和雙鏈DNA結(jié)合的特性，通過對(duì)試驗(yàn)條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)VTEC的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。試驗(yàn)中能夠檢出液體樣品中的VTEC細(xì)菌數(shù)量可達(dá)10cfu/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性、敏感性、重復(fù)性均達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。 試驗(yàn)二VTEC多重?zé)晒釶CR法在VTEC快速檢測(cè)中的應(yīng)用應(yīng)用試驗(yàn)一建立的方法檢測(cè)樣品，樣品來源有兩部分，一部分是模擬陽性樣品，