多重PCR檢測沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、食品中污染的病原細(xì)菌是引起食源性疾病的主要因素之一，快速檢測食品中病原細(xì)菌是及時(shí)有效預(yù)防病原細(xì)菌傳播及食物中毒的重要前提。目前病原細(xì)菌的檢測主要依靠常規(guī)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)方法，一般需4～7d，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力；多重PCR作為一種可同時(shí)檢測多種病原細(xì)菌的方法發(fā)展十分迅速。本研究建立了沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測技術(shù)，并初步應(yīng)用于湖北省出入境檢驗(yàn)檢疫局部分出口食品樣品的檢測中，主要研究結(jié)果如下： 1 沙門菌、大腸桿

2、菌和金黃色葡萄球菌多重PCR引物設(shè)計(jì)及特異性分析 （1）根據(jù)沙門菌invA基因、大腸桿菌phoA基因和金黃色葡萄球菌nuc基因序列，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物并通過Oligo 6.0進(jìn)行分析，確保引物之間無二聚體形成，并對(duì)各引物間的互補(bǔ)性、最佳退火溫度進(jìn)行了分析，同時(shí)應(yīng)用BLAST程序，通過GeneBank對(duì)各引物及擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行同源性對(duì)比，獲得三對(duì)特異性引物。 （2）優(yōu)化沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌PCR反應(yīng)條

3、件，進(jìn)行了引物特異性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果設(shè)計(jì)的沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引物能特異的擴(kuò)增出284bp、622bp、484bp的目的條帶，對(duì)照菌株均為陰性。引物間無交叉反應(yīng)，特異性好。 2　沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測方法的建立 經(jīng)過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了多重PCR最佳反應(yīng)條件為沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的引物濃度分別為40nmol／L、40nmol／L、80nmol／L，Mg<'2+>濃度2.4mmol／L，

4、dNTP濃度200μmol／L，Taq DNA聚合酶1.5U。循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性7min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。在此條件下多重PCR同時(shí)檢測沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌DNA的敏感性分別是10.2pg、10.2pg、102pg。 3 同時(shí)富集沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌增菌培養(yǎng)基的研究 本研究設(shè)計(jì)出一種能同時(shí)富集培養(yǎng)沙門菌、大腸桿菌和金

5、黃色葡萄球菌的緩沖鹽水肉湯（buffed saline broth，BSB），其主要組分和含量為：蛋白胨10g、牛肉膏3g、磷酸氫二鈉（Na2HPO<,4>·12H<,2>O）9g、磷酸二氫鉀1.5g、添加劑50g、蒸餾水1000mL，pH7.2。 4　多重PCR檢測方法的應(yīng)用與評(píng)價(jià) 對(duì)10份人為接種病原菌牛奶樣品、20份污水樣品和50份湖北省出入境檢驗(yàn)檢疫局出口蝦樣品，多重PCR和國標(biāo)方法均有9份沙門菌陽性，27份大腸