肉中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌雙重實時PCR法的建立.pdf

1、食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因，對人類健康危害很大，其中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌是兩種常見的致病菌。單增李斯特菌可引起敗血癥、腦炎、腦膜炎、膿腫及孕婦流產(chǎn)等一系列食源性李斯特菌病，病死率高達(dá)30％～70%。由于該菌在4℃冰箱保存的食物中也可生長繁殖，故其危害性進(jìn)一步增大。金黃色葡萄球菌是引起食源性葡萄球菌病最常見種類，可引起嘔吐、腹瀉等臨床癥狀。兩種菌在自然界均廣泛存在，人們食用的肉、奶、蛋、水產(chǎn)品和蔬菜常受到這兩種菌不同程

2、度的污染，其中以肉和肉制品污染最為嚴(yán)重。因此，建立肉中這兩種致病菌的快速、可靠的檢測方法具有重要的實際意義。熒光定量PCR技術(shù)融匯了PCR的高效擴(kuò)增、核酸探針雜交技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性定量的優(yōu)點。根據(jù)熒光定量PCR儀多通道的激發(fā)光源，可達(dá)到同時檢測多種細(xì)菌的目的。目前為止還未見運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)同時檢測肉中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的報道，故本試驗對肉中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法進(jìn)行研究，

3、以期能夠快速、準(zhǔn)確的檢測肉中這兩種致病菌，從而達(dá)到預(yù)防和控制由這兩種菌引起的疾病的目的。
　　 以單增李斯特菌hlyA基因和金黃色葡萄球菌nuc基因為靶基因，分別設(shè)計一對引物和一條TaqMan探針，在構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，分別建立基于TaqMan探針的檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的單一熒光定量PCR方法，并分析其特異性、敏感性和重復(fù)性。特異性結(jié)果顯示，對于單增李斯特菌熒光定量PCR方法，10株單增李斯特菌均產(chǎn)生S型擴(kuò)增曲

4、線，其它6株非單增李斯特菌均不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線；對于金黃色葡萄球菌的熒光定量PCR方法，5株金黃色葡萄球菌均產(chǎn)生S型擴(kuò)增曲線，其它6株非金黃色葡萄球菌均不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。敏感性結(jié)果顯示，建立的單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.998(R2=0.998)和0.997(R2=0.997)，敏感性分別為39和37.4拷貝數(shù)。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，建立的單增李斯特菌熒光定量PCR方法和金黃色葡萄球菌熒光定量PCR方法組內(nèi)變異系數(shù)均

5、小于1%，組間變異系數(shù)均小于2%。
　　 在單一熒光定量PCR方法的基礎(chǔ)上，建立單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重?zé)晒舛縋CR方法，分析兩者的交叉反應(yīng)，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線分析方法的敏感性。結(jié)果表明，單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌兩者在建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法中互不影響各自的擴(kuò)增效率，兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，該法檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的敏感性分別為19.5拷貝/μL和18.7拷貝/μL。
　　 將建

6、立的單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌雙重?zé)晒舛縋CR方法應(yīng)用到人工模擬肉樣的檢測，確定這兩種致病菌在人工模擬肉樣中的最低檢測限，建立肉中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法。結(jié)果表明，建立的肉中這兩種致病菌的雙重?zé)晒舛縋CR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線在106～101cfu/mL范圍內(nèi)相關(guān)性良好，最低檢測限均為10cfu/mL。包括基因組提取在內(nèi)的整個檢測過程只需約3個小時，建立的方法可用于肉中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的同步、