金黃色葡萄球菌耐藥基因多重PCR快速檢測體系的建立及其臨床應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌是重要的醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染菌，所引發(fā)疾病譜廣泛，可以是皮膚感染，也可致心內(nèi)膜炎、菌血癥等致死性疾病。自二十世紀(jì)七十年代中期以來，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus，MRSA)已成為英格蘭、美國、澳大利亞及愛爾蘭等國大規(guī)模感染暴發(fā)的重要原因[1]。近二十年來，遏制MRSA播散己成為醫(yī)院感染首要解決的問題[2]。 隨著近年來包含金黃色葡萄球菌在

2、內(nèi)所引起的多種傳染性疾病在全球所呈現(xiàn)的上升趨勢，抗菌藥物的使用越來越廣泛，越來越大的抗菌藥物選擇壓力下所出現(xiàn)的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，新的耐藥基因型和復(fù)合耐藥基因型將不斷出現(xiàn)。而耐藥基因在病原微生物之間的擴(kuò)散，以及不同的抗菌藥物使用習(xí)慣可能導(dǎo)致細(xì)菌具有不同的地區(qū)特征性的耐藥基因型分布。因此，明確地區(qū)性細(xì)菌耐藥模式對該地區(qū)細(xì)菌感染的有效治療與控制具有重要的指導(dǎo)價值。 目前，臨床上主要通過檢測細(xì)菌耐藥表型確定其耐藥模式，然而，此類傳統(tǒng)的耐

3、藥表型檢測，耗時且不能檢測出因故未能表達(dá)的耐藥基因。而PCR技術(shù)可從分子水平明確細(xì)菌耐藥機(jī)制，但常規(guī)單重PCR反應(yīng)每次只能檢測細(xì)菌的一種耐藥基因；因而，能同步檢測復(fù)合耐藥基因型的多重PCR快速檢測體系，簡便、快捷、有效，目前已成為探究臨床菌株耐藥分子機(jī)制及監(jiān)測臨床耐藥基因型分布的重要手段之一，是臨床藥敏試驗的重要補(bǔ)充，對耐藥菌株的臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。 目的： 為了解廣州地區(qū)分離的金黃色葡萄球菌對常用抗菌藥物β-內(nèi)

4、酰胺酶抗菌藥物、大環(huán)內(nèi)酯類-林可酰胺類.鏈陽霉素B類抗菌藥物(MLSB)和氨基糖甙類藥物耐藥相關(guān)基因型的分布規(guī)律，以指導(dǎo)臨床用藥，本研究基于金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA(determinantofmethicillinresistance，甲氧西林耐藥決定因子)、ermA、ermC(erm:erythromycinribosomemethylase，紅霉素核糖體甲基化酶)、acc(6')-Ie+aph(2")(aac:aminogly

5、cosideacetyltransferases，氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，aph:aminoglycosidephosphotransferases，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶)、ant(4')-Ia(ant:aminoglycosidenucleotidyltransferases，氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶)和aph(3')-Ⅲa以及內(nèi)參照基因16SrRNA，構(gòu)建了多重PCR快速檢測體系，并對自廣州地區(qū)臨床標(biāo)本分離的124株金黃色葡萄球菌進(jìn)行臨床應(yīng)用評

6、價。 方法： 1.自GenBank獲取目前全球已報道的金黃色葡萄球菌耐藥相關(guān)基因mecA、ermA、ermC、acc(6')-Ie+aph(2")、ant(4')-Ia和aph(3')-Ⅲa及其內(nèi)參照基因16SrRNA序列，利用DNAMAN、Lasergene、VectorNTI等多種生物信息學(xué)分析軟件和BLAST等網(wǎng)上數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行綜合分析，以錨定、設(shè)計各耐藥基因特異性的PCR檢測靶片段及其多重檢測引物對。

7、2.自廣州地區(qū)臨床標(biāo)本分離的124株金黃色葡萄球菌，按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[3]分離菌株；利用PHOENIX-100及VITEK-60微生物自動鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定；采用苯唑西林-4％NaCl瓊脂篩選法進(jìn)行金黃色葡萄球菌耐甲氧西林表型的檢測[4]；以紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥實驗(D-試驗)檢測克林霉素誘導(dǎo)耐藥啼[5]；以瓊脂擴(kuò)散法(改良Kirby-Bauer法)進(jìn)行氨基糖甙類抗菌藥物表型的檢測；以改良的小量細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒

8、提取菌株基因組DNA。 3.以所設(shè)計的耐藥基因多重檢測引物對，優(yōu)化組合以構(gòu)建四重、七重PCR快速檢測體系，并對已經(jīng)傳統(tǒng)藥敏方法檢測的124株金黃色葡萄球菌進(jìn)行相關(guān)耐藥基因的檢測分析。 4.采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理。 結(jié)果： 1.金黃色葡萄球菌耐甲氧西林表型檢測結(jié)果：124株金黃色葡萄球菌經(jīng)苯唑西林一鹽瓊脂篩選法檢測，73株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，陽性率58.9％。 2.

9、金黃色葡萄球菌耐藥表型檢測結(jié)果：紅霉素、克林霉素、慶大霉素、奈替米星、妥布霉素、阿米卡星耐藥率分別為：71.0％(88/124)、66.1％(82/124)、58.9％(73/124)、25.0％(31/124)、64.5％(80/124)、53.2％(66/124)。 3.紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥實驗(D-試驗)結(jié)果：88株紅霉素耐藥金黃色葡萄球菌中，14株為誘導(dǎo)型耐藥，D-試驗陽性率15.9％。 4.成功構(gòu)建β-內(nèi)酰胺

10、抗菌藥物耐藥基因mecA、MLSB耐藥基因ermA、ermC及內(nèi)參照基因16SrRNA的金黃色葡萄球菌四重PCR快速檢測體系1。用于臨床分離的124株金黃色葡萄菌耐藥基因型分布檢測，mecA、ermA、ermC檢出率分別為59.7％(74/124)、50.096(62/124)、33.9％(42/124)；73株MRSA均檢測出mecA基因；在88株耐紅霉素金黃色葡萄球菌中，62株攜帶ermA基因，40株攜帶ermC基因，16株同時攜帶

11、ermA、ermC基因；克林霉素誘導(dǎo)耐藥菌株主要是ermC基因介導(dǎo)，14株誘導(dǎo)試驗陽性金黃色葡萄球菌中，10株菌檢測出ermC基因。 5.成功構(gòu)建氨基糖甙類抗菌藥物耐藥基因acc(6')-Ie+aph(2")、ant(4')-Ia和aph(3')-Ⅲa及內(nèi)參照基因16SrRNA的金黃色葡萄球菌四重PCR快速檢測體系2。用于臨床分離的124株金黃色葡萄菌耐藥基因型分布檢測，acc(6')-Ie+aph(2")、aph(3')-Ⅲa

12、和ant(4')-Ia檢出率分別為62.1％(77/124)、32.3％(40/124)和1.6％(2/124)；所有慶大霉素、奈替米星以及阿米卡星耐藥的金黃色葡萄球菌菌株均檢測到上述三個耐藥基因中的一個或一個以上；80株妥布霉素耐藥金黃色葡萄球菌有5株菌未能檢出耐藥基因；74株mecA陽性菌株有72株(97.3％)檢測到acc(6')-Ie+aph(2")基因。 6.進(jìn)一步優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件，基于上述四重PCR反應(yīng)體系，初

13、步構(gòu)建耐藥基因mecA、ermA、ermC、acc(6')-Ie+aph(2")、ant(4')-Ia和aph(3')-Ⅲa及內(nèi)參照基因16SrRNA七重PCR快速檢測體系。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建金黃色葡萄球菌耐藥基因多重PCR快速檢測體系，能高效、快速地分別檢測其常用抗菌藥物β-內(nèi)酰胺抗菌藥物、大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類-鏈陽菌素B及氨基糖甙抗菌藥物相關(guān)耐藥基因mecA、ermA、ermC、acc(6')-Ie+aph(2"

14、)、aph(3')-Ⅲa和ant(4')-Ia，其對耐藥基因型的檢測判定與傳統(tǒng)菌株耐藥表型的分析具有很好的相關(guān)性。 2.在廣州地區(qū)分離的124株金黃色葡萄球菌中，mecA和ermA、ermC是引起β-內(nèi)酰胺抗菌藥物和大環(huán)內(nèi)酯類-林可酰胺類-鏈陽菌素B類抗菌藥物耐藥的主要分子機(jī)制。誘導(dǎo)型MLSB耐藥菌株以攜帶ermC基因為主；而編碼AAC(6')-APH(2")雙功能酶的acc(6')-Ie+aph(2")基因是金黃色葡萄球菌最重