金黃色葡萄球菌eap基因克隆表達及雙重PCR檢測方法建立.pdf

1、目的:
　　 1.構建鵝源金黃色葡萄球菌eap靶基因原核表達載體，并初步研究目的蛋白的免疫學活性及其應用。
　　 2.金黃色葡萄球菌eap靶基因雙重PCR檢測方法的建立。
　　 方法:
　　 1.依據(jù)Genebank中公布的eap基因全長信息，PCR擴增內(nèi)蒙古鵝源分離株的eap基因片段，將純化回收后的目的片段克隆到pMD18-TVector載體上，經(jīng)實驗室PCR擴增和單雙酶切鑒定，鑒定正確后測序分析。測序

2、分析正確后構建pET28a-eap重組質(zhì)粒并轉化到大腸桿菌E.coliBL21中。經(jīng)IPTG誘導SDS-PAGE鑒定成功后，用Ni-NTA親和柱獲取的純化的Eap蛋白和全菌體滅活菌苗分別免疫家兔，應用Western-blot方法檢測重組Eap蛋白的免疫活性。建立間接ELISA方法，研究目的蛋白的反應原性。
　　 2.以金黃色葡萄球菌的eap基因為靶基因設計引物，通過PCR擴增技術檢測100株由臨床采集并分離的細菌。首先對臨床采集

3、的100株標本進行分離純化并根據(jù)生物學特性進行大致區(qū)分。通過國際公認的葡萄球菌特異性基因16srRNA與金黃色葡萄球菌特異性eap基因序列雙重分析法鑒定，其中有57株為目的菌。
　　 結果:
　　 1.成功構建pET28a-eap/BL21，在pET28a(+)系統(tǒng)中成功表達了Eap融合蛋白，獲得小量純化的Eap重組目的蛋白。
　　 2.成功應用葡萄球菌特異性基因16srRNA和金黃色葡萄球菌特異性eap基因為檢