環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)肉制品產(chǎn)毒素性大腸桿菌的研究.pdf

1、病原微生物與食品污染構(gòu)成了一個(gè)巨大并不斷擴(kuò)大的世界性公共衛(wèi)生問題。產(chǎn)毒素性大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一。傳統(tǒng)方法操作繁瑣,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),而且靈敏度較低;免疫學(xué)檢測(cè)方法特異性和靈敏度不理想;PCR方法敏感、快速,但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過程,難以在基層普及和推廣。為確保食品安全與食品貿(mào)易,需要大力加強(qiáng)食品檢驗(yàn)的力度,迫切需要建立快速、靈敏的產(chǎn)毒素性大腸桿菌的檢驗(yàn)方法。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

2、技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification,簡(jiǎn)稱LAMP)是日本學(xué)者Notomi等于2000年發(fā)明的一種全新的核酸擴(kuò)增方法。該技術(shù)利用能識(shí)別靶序列上6個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)特殊的引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下,特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增核酸。
　　 本研究采用LAMP技術(shù),針對(duì)產(chǎn)毒素性大腸桿菌耐熱腸毒素(heatstableenterotoxin,ST)基因保守序列為靶序列運(yùn)用在線引物

3、設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物,同時(shí)驗(yàn)證了引物的特異性及可行性。對(duì)BST酶添加量、dNTP濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,確定25μL的LAMP反應(yīng)體系為:內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.2μM,外引物(F3和B3)各0.3μM,0.5mMdNTP,4mMMgCl2,10×BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液,7.2U的BstDNA聚

4、合酶大片段,2μLDNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)過程是首先在62℃水浴鍋中反應(yīng)30min,然后將其放入80℃水浴鍋中,水浴10min終止反應(yīng),通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀,即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。此外,取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳,觀察梯形條帶,以證實(shí)是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。
　　 為了比較LAMP檢測(cè)產(chǎn)毒素性大腸桿菌的靈敏度和人工污染檢出限,以PCR方法作對(duì)照。PCR引物是LAMP的兩條外引物(

5、F3和B3)。結(jié)果表明,LAMP檢測(cè)產(chǎn)毒素性大腸桿菌的靈敏度為45.6CFU/mL,人工污染的生豬肉的檢出限為63CFU/g。采用試劑盒提取DNA,從樣品處理到報(bào)告結(jié)果,耗時(shí)1h。對(duì)照PCR耗時(shí)3h,檢測(cè)產(chǎn)毒素性大腸桿菌的靈敏度為4.56×102CFU/mL,人工污染產(chǎn)毒素性大腸桿菌的生豬肉的檢出限為6.3×102CFU/g。LAMP的靈敏度是PCR的10倍。
　　 研究表明:LAMP技術(shù)是一種檢測(cè)程序簡(jiǎn)單、靈敏度和特異性較高的