重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)快速檢測煙曲霉菌.pdf

1、目的：以煙曲霉內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSD)為靶序列，篩選煙曲霉菌特異性的引物對，應(yīng)用重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴增(RPA)技術(shù)建立快速檢測煙曲霉的新方法并對該檢測方法進行方法學(xué)優(yōu)化。
　　方法：
　　(1)以煙曲霉菌的易變區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為靶序列，先用Primer-5軟件在不同區(qū)間設(shè)計三條上游引物和三條下游引物，交叉配對組成不同引物對，然后將引物逐一進行Primer-blast，篩選煙曲霉的特異性引物。
　　(2)應(yīng)用機械性玻璃

2、珠打擊裂解法抽提獲得煙曲霉標準菌株的DNA。
　　(3)通過優(yōu)化RPA檢測煙曲霉的引物長度、產(chǎn)物長度、擴增時間及擴增溫度等檢測條件，建立檢測煙曲霉的新方法。
　　(4)通過交叉擴增實驗及檢測不同濃度煙曲霉DNA樣品來評估RPA檢測煙曲霉菌的敏感性和特異性。
　　(5)通過對21株臨床分離的人致病性曲霉菌菌株的檢測來評估RPA技術(shù)的臨床檢測性能。
　　(6)通過RPA與PCR同時進行敏感性、特異性、臨床分離曲霉菌檢

3、測實驗，對RPA與PCR技術(shù)進行方法學(xué)比較。
　　結(jié)果：
　　(1)篩選得到煙曲霉特異性的引物為上游位于ITSD1、下游位于ITSD2、擴增產(chǎn)物為489bp的引物。引物序列為:上游引物:5'-GGTCCAACCTCCCACCCGTGTCTATC-3'，下游引物:5'-TTAGAAAAATAAAGTTGGGTGTCGGC-3'
　　(2)通過機械性玻璃珠打擊裂解法抽提獲得的煙曲霉基因組DNA在純度和的量上能夠滿足核酸擴增

4、需要，且簡便、快速。
　　(3) RPA技術(shù)檢測煙曲霉菌的優(yōu)化反應(yīng)條件為:引物長度范圍為18-32bp;擴增產(chǎn)物長度范圍為200-700bp;擴增溫度為37-42℃;擴增時間為15-40min。
　　(4) RPA特異性和敏感性:不同曲霉菌種交叉擴增實驗顯示，RPA只在煙曲霉菌擴增中有明顯的特異性條帶，而對黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、中國紅酵母均無擴增。在以瓊脂糖凝膠電泳為檢測平臺時，RPA可以檢測到最低濃度為100p

5、g/μl的煙曲霉DNA樣品。
　　(5)21株臨床分離的人致病性曲霉菌檢測實驗中，RPA對18株煙曲霉分離菌株的擴增均為陽性，而3株黃曲霉擴增均為陰性。
　　(6)通過對RPA和PCR檢測煙曲霉方法學(xué)的比較，RPA和PCR一樣具有很高的敏感性和很強的特異性。
　　結(jié)論：本研究通過Primer-Blast篩選針對煙曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的特異性引物。在優(yōu)化反應(yīng)條件下，應(yīng)用此特異性引物建立的RPA檢測煙曲霉方法