副豬嗜血桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法的建立.pdf

1、副豬嗜血桿菌病（Haemophilusparasuis，Hps）又稱多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，也稱革拉瑟氏病(Glasser'sdisease)，由副豬嗜血桿菌引起。副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在菌，在正常條件下不表現(xiàn)任何臨床癥狀，但在特定條件下可引起嚴(yán)重的全身性疾病。該菌在環(huán)境中普遍存在，世界各地都有。近些年來隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的新發(fā)細(xì)菌性傳染病，它常作為繼發(fā)的病原菌和其它主要病原混合感染，給

2、全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，故建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法是成功防治該病的關(guān)鍵。
　　 目前針對副豬嗜血桿菌的檢測方法主要有細(xì)菌分離培養(yǎng)、免疫學(xué)（抗體監(jiān)測）方法及PCR法。但副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)操作極其繁瑣，檢測所需時間長且靈敏度低;免疫學(xué)方法的靈敏度也不理想，PCR法雖敏感、快速但其需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，使其很難在基層推廣應(yīng)用。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediate

3、disothermalamplification，LAMP）是由日本科學(xué)家Notomi研發(fā)的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，它能夠在恒溫條件下特異性地?cái)U(kuò)增靶序列，該法以高效、快速且成本低廉、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)迅速在諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
　　 本試驗(yàn)是采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測副豬嗜血桿菌，以副豬嗜血桿菌的高保守序列OMPP2基因序列(NZ_ABKM01000007.1)為靶基因，根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)的原則，應(yīng)用PrimerExplorer3.0軟件

4、針對6個特定區(qū)域，設(shè)計(jì)出4條特異性引物。在鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，對模板DNA進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，并對LAMP反應(yīng)體系中內(nèi)外(F3∶FIP和B3∶BIP)引物、MgSO4、dNTP及Bst酶的濃度、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了25μL的LAMP最佳反應(yīng)體系:內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.6mmol/L，外引物（F3和B3）各0.2mmol/L;鎂離子的濃度為3.0mmol/L;dNT

5、P濃度為3.0mmol/L;8U的BstDNA聚合酶的添加量為0.8μL，2.5μL10×BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2μLDNA模板，并用無菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP的基本反應(yīng)過程為:先將反應(yīng)混合物置于62℃水浴鍋中反應(yīng)40min，然后在80℃水浴鍋中水浴10min終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀來判斷LAMP反應(yīng)是否發(fā)生，亦可加入熒光染料或用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
　　 以PCR方法作為對照，測定LAMP

6、法的靈敏度。結(jié)果表明，PCR最低檢測DNA量為20pg/μL;而LAMP最低檢測DNA量為0.2pg/μL，LAMP比PCR方法敏感100倍;同時利用LAMP方法對豬胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸炎病毒以及豬肺炎支原體9種常見病原進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明，9種病原體LAMP反應(yīng)均為陰性，說明LAMP方法具有良好的特異性。
　　 綜上，本試驗(yàn)建立的LAMP體