豬弓形蟲病環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測技術(shù)的建立與評價.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，其常用的診斷方法包括病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法。但這些方法在特異性、簡便程度、溫度和試劑儀器要求等方面各有缺點(diǎn)。因此，建立一種既敏感、特異，又簡便實(shí)用的弓形蟲病診斷方法是迫切需要的。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)通過具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶完成靶序列的擴(kuò)增，僅需恒溫加熱就能

2、擴(kuò)增DNA，可以通過觀察利用核酸染料染色觀察而直接判定結(jié)果，具有簡便、快速的特點(diǎn)。 本研究利用多拷貝的弓形蟲AF146527基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物并建立了LAMP檢測方法，以1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的方法對反應(yīng)體系(包括鎂離子、甜菜堿濃度)及反應(yīng)條件(包括反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間)進(jìn)行了優(yōu)化。通過1.5％瓊脂糖凝膠染色及PicoGreen染色確定LAMP檢測敏感性并與常規(guī)PCR檢測方法進(jìn)行敏感性比較。結(jié)果表明，當(dāng)采用6 mmo

3、I/LMg<'2+>、0.8mmol/L的甜菜堿的反應(yīng)體系，63℃反應(yīng)60min即可完成檢測，所建立的弓形蟲LAMP檢測方法敏感性達(dá)到6.4pg質(zhì)粒。采用LAMP的一對外引物作為常規(guī)PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測弓形蟲的敏感性只有128pg，即采用LAMP方法檢測弓形蟲的敏感性是常規(guī)PCR檢測的20倍，直接采用PicoGreen染色觀察也得到相同的結(jié)果，而且同球蟲、隱孢子蟲及豬組織DNA沒有交叉反應(yīng)。即環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測技術(shù)(LAMP)是