環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測(cè)幃類中副溶血弧菌的研究.pdf

1、副溶血性弧菌是我國(guó)一種重要的食源性病原菌,可引起急性腸胃炎,少數(shù)情況還能引發(fā)敗血病,危及生命。副溶血性弧菌引起的疾病已成為我國(guó)一個(gè)嚴(yán)重的食源性公共衛(wèi)生問題之一,該菌引發(fā)的疾病居微生物性食源性疾病暴發(fā)之首,目前發(fā)病人數(shù)呈顯著上升趨勢(shì)。特別在沿海地區(qū),發(fā)病起數(shù)和涉及人數(shù)較我國(guó)其它地區(qū)更為嚴(yán)重,因此,必須建立可靠的快速檢測(cè)方法,持續(xù)地進(jìn)行水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)和污染控制。目前對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的分離鑒定方法,免疫學(xué)方法

2、和分子生物學(xué)檢測(cè)方法等。傳統(tǒng)檢測(cè)方法操作繁瑣,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),而且靈敏度較低；免疫學(xué)方法的特異性和靈敏度也不理想;PCR方法敏感、快速,但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過程,而使其難以在基層普及和推廣。2000年,Notomi等開發(fā)出一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù),環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,簡(jiǎn)稱LAMP),該技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)在病毒、真菌

3、、細(xì)菌以及轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中得到應(yīng)用。因此,建立LAMP技術(shù)檢測(cè)副溶血弧菌對(duì)于控制副溶血弧菌的食物中毒具有重要意義。
　　 本文以副溶血弧菌具有種特異性的gyrB基因?yàn)榘谢?基因號(hào)AY527390),應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(https:／／primerexplorer.jp／lamp3.0.0／index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)貝肉中的副溶血弧菌。對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,

4、確定25μL的LAMP反應(yīng)體系為:內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.6μmol／L,外引物(F3和B3)各0.2μmol／L,環(huán)引物(LF和LB)各0.8μmol／L,0.6mmol／LdNTP,2mmol／L Mg2+,2.5μL10×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液,8u的Bst DNA聚合酶大片段,1μL DNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)過程是首先在65℃水浴鍋中反應(yīng)40min,然后將其放入80℃水浴鍋中,水浴5min終止

5、反應(yīng),通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀,即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應(yīng),亦可通過瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)反應(yīng)是否發(fā)生。本研究對(duì)13株副溶血弧菌、14株弧菌屬菌株和19株非弧菌屬菌株作對(duì)照,驗(yàn)證方法特異性,結(jié)果表明,13株副溶血弧菌檢測(cè)結(jié)果為陽性,其他33株菌株為陰性。初步研究了6種從人工污染副溶血弧菌的貝肉中提取模板DNA的方法,結(jié)果表明,LAMP對(duì)制備模板DNA方法的要求不高。本研究對(duì)LAMP法快速檢測(cè)副溶血弧菌進(jìn)行了研究,確定了檢測(cè)純培養(yǎng)

6、物的靈敏度,人工污染檢出限,并與普通PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明:LAMP檢測(cè)副溶血弧菌純培養(yǎng)物的靈敏度為19CFU／mL,人工污染副溶血弧菌的貝肉檢出限為87CFU／g。采用試劑盒提取DNA,從樣品處理到報(bào)告結(jié)果,耗時(shí)2h。而對(duì)照,PCR檢測(cè)副溶血弧菌純培養(yǎng)物的靈敏度為1900CFU／mL,人工污染副溶血弧菌的檢出限為8700 CFU／g。采用同樣方法提取DNA,從樣品處理到報(bào)告結(jié)果,耗時(shí)4 h。模擬貝肉樣品含副溶血弧菌1CFU