裂谷熱病毒Real-time PCR檢測方法的建立及其G2部分蛋白的原核表達(dá).pdf

1、裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)為白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)布尼病毒科(Bunyaviridae)成員,是引起裂谷熱(Rift Valley fever,RVF)的病原.該研究一方面建立了兩種Real-time PCR技術(shù)快速檢測裂谷熱;另一方面使用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)了裂谷熱病毒G2蛋白部分序列,為其免疫學(xué)檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ).通過對G2基因的序列分析,設(shè)計(jì)了一對用于SYBR Gree

2、n Ⅰ熒光染料的PCR引物,重組質(zhì)粒pLSEG-RVFV經(jīng)測定濃度和純度后,用作Real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn)品.通過Blast和常規(guī)PCR鑒定引物的特異性,熔解曲線區(qū)分特異性片斷和非特異性擴(kuò)增,經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)程序、Mg<'2+>濃度和退火溫度等Real-time PCR反應(yīng)條件,確定該P(yáng)CR方法采用兩步法,Mg<'2+>的最佳濃度為3.5mM,最佳退火溫度為60℃.該方法在DNA水平上的檢測范圍為3×10<'6>至3×10<'2>c/

3、r時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好(R<'2>=0.998),并且具有良好的可重復(fù)性.另外,通過G2蛋白的結(jié)構(gòu)分析,確定了其抗原性較高的部位,用常規(guī)PCR擴(kuò)增出目的片段,克隆到質(zhì)粒載體pET32a中,通過菌落PCR和限制性內(nèi)切酶法篩選出陽性重組質(zhì)粒,最后通過測序確認(rèn),將重組質(zhì)粒命名為pET32-RG2p;將pET32-RG2p轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3),目的蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot分析,結(jié)果