Real-time RT-PCR檢測JEV方法的建立與JEV入侵BHK-21細(xì)胞內(nèi)吞途徑的初步研究.pdf

1、流行性乙型腦炎是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的嚴(yán)重危害人畜健康的一種蟲媒傳染病。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是感染早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，病毒和細(xì)胞的不同，病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式和途徑也不同。本研究建立了Real-time RT-PCR檢測日本乙型腦炎病毒的方法，并應(yīng)用該方法對日本乙型腦炎病毒入侵細(xì)胞的內(nèi)吞途徑進(jìn)行了初步研究。
　　 1. Real-time RT-PCR檢測JEV方法的建立

2、
　　 本文根據(jù)GenBank登錄的JEV(SA14-14-2)序列，設(shè)計合成了一對特異性引物，構(gòu)建了JEV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立了實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timeRT-PCR)檢測JEV的診斷方法。通過檢測10倍系列稀釋的JEV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板顯示，該方法的靈敏度能達(dá)到15copies。對不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，其變異系數(shù)(CV)均小于5％，顯示該方法具有良好的重復(fù)性；對乙型腦炎病毒(JEV)、豬瘟病

3、毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)等病毒進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示該方法對JEV具有高度特異性。該方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=-0.3007X+10.53，擬合度r2=0.997,PCR循環(huán)效率為96.53％；研究結(jié)果表明，該方法快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好且能實(shí)時定量檢測，可用于JEV分離鑒定、JEV感染疑似病例檢測、JEV感染定量檢測研究及其分子流行病學(xué)調(diào)查。
　　 2.日本乙型腦炎病毒入侵BHK-21細(xì)胞

4、的內(nèi)吞途徑初步研究
　　 本試驗(yàn)選用氯丙嗪、制霉素和細(xì)胞松弛素D三種藥物分別處理細(xì)胞，以阻滯網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞途徑、細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷途徑和巨胞飲途徑，然后進(jìn)行JEV感染實(shí)驗(yàn)，通過Real-time RT-PCR方法測定感染后1h、12h、24h細(xì)胞內(nèi)的病毒拷貝數(shù)，結(jié)果顯示：與僅實(shí)施感染實(shí)驗(yàn)、未進(jìn)行藥物處理的對照組比較，三個藥物處理組的細(xì)胞內(nèi)病毒拷貝數(shù)，在感染后各時相點(diǎn)均呈現(xiàn)不同程度的下降，其中氯丙嗪處理組下降最為明顯，感染后1h、1