應用Real-time RT-PCR進行胃癌腹膜亞臨床轉移相關標志物的檢測.pdf

1、胃癌在我國具有很高的發(fā)病率，死亡率居惡性腫瘤之首。胃癌的主要治療手段是根治手術，術后5年生存率約為40％，其中約30％～50％的患者發(fā)生腹膜轉移，是導致患者死亡的重要原因。腹膜轉移病灶一旦形成，即為臨床轉移，治療則陷入十分困難的境地。 胃癌細胞脫落入腹腔后，其在腹腔內的生物學活動導致許多特異性分子標志物的產生，因此能夠檢測到這些特異性分子標志物的存在就證明了腹腔中脫落腫瘤細胞的存在。我們利用各種分子生物學方法在胃癌患者的腹腔沖洗

2、液中檢測與胃癌腹膜轉移相關并能敏感表達的特異性分子標志物，以期提高脫落腫瘤細胞的檢出率。但是，目前各種研究結果并不一致，哪種指標能夠做為良好的檢測標志物來切實有效的提高脫落腫瘤細胞的檢出率，尚無法達成共識。近年來隨著實時熒光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)的應用，能夠實時定量檢測到微量的mRNA，因而能夠更準確的反映腹腔游離癌細胞的存在。 本研究選取與胃癌腹膜轉移密切相關的8種分子生物學標志物，應用Real-

3、Time RT-PCR方法對115例胃癌患者的腹腔沖洗液進行檢測，另選取10例良性疾病患者的腹腔沖洗液作為陰性對照，對上述標志物進行檢測，以期找出能夠提高脫落腫瘤細胞檢出率的指標，用以指導臨床的診斷治療。 材料與方法： 一、標本采集 收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科2007～2008年間胃癌患者腹腔沖洗液115例。 二、實驗分組 根據腹腔沖洗液細胞學檢查(PLC)診斷結果分組為：PLC(—)組

4、、PLC(+)組、PLC(±)組及良性疾病腹腔沖洗液對照組。 三、提取腹腔沖洗液總RNA TRIZOL法提取胃癌腹腔沖洗液標本中的總RNA，取少量RNA用于含量及純度測定，其余分裝后置—80℃保存待用。 四、 Real-Time RT-PCR擴增各目的基因mRNA (一)應用反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA。 (二)Real-Time RT-PCR擴增各個分子指標，以β—actin做內對照

5、。 (三)Rotor—Gene3000實時定量系統(tǒng)分析各基因表達情況。 五、統(tǒng)計學分析 實驗數據應用軟件SPSS13.0分析，選用X2檢驗、方差分析、Mann—Whitney檢驗及Kruskal—Wallis檢驗對數據結果進行分析。 結果： 一、PLC檢查結果及分組 PLC(一)組：66例，57.3％(66/115)；PLC(+)組：31例，27.0％(31/115)；PLC(±)組：1

6、8例，15.7％(18/115)。 二、Real-Time RT-PCR檢測腹腔沖洗液中各指標表達陽性率 CEA：39.1％(45/115)；DDC：34.8％(40/115)；HPA：33.0％(38/115)：MMP—7：31.3％(36/115)；Ki—67：30.4％(35/115)；TGF-β1：28.7％(33/115)；PCNA：25.2％(29/115)；L—3-PP：24.3％(28/115)。

7、 三、ROC曲線分析各目的基因診斷價值 通過比較各指標ROC曲線下面積，各基因診斷價值順序如下：CEA>DDC>HPA> MMP—7>Ki—67>TGF-β1>PCNA>L—3-PP。 四、各目的基因表達與胃癌腹膜轉移相關臨床病理因素比較 PLC結果陽性的31例病例中，各指標的陽性率依次為CEA93.5％(29/31)、DDC90.3％(28/31)、HPA87.1％(27/31)、MMP—777.4％(24

8、/31)、Ki—6771.0％(22/31)、TGF-β161.3％(19/31)、PCNA54.8％(17/31)和L—3-PP45.2％(14/31)。其中CEA、DDC、HPA的表達陽性率要明顯高于其他5種標志物(P<0.05)，顯示了良好的敏感性。 肉眼腹膜轉移陽性的14例病例中，各指標的陽性率依次為CEA100％(14/14)、DDC100％(14/14)、HPA92.9％(13/14)、MMP—778.6％(11/1

9、4)、Ki—6771.4％(10/14)、TGF-Pi64.3％(9/14)、PCNA64.3％(9/14)和L—3-PP57.1％(8/14)。其中CEA、DDC、HPA、MMP—7的表達陽性率要明顯高于其他4種標志物(P<0.05)，顯示了良好的敏感性。 CEA、DDC及HPA的表達與胃癌的浸潤深度、漿膜類型、胃癌生長方式及胃癌的大體類型相關(P<0.05)。 結論： (1)CEA、DDC、HPA作為胃癌腹