硬蜱耐藥基因D6的獲得與ReaL-time PCR檢測方法的建立.pdf

1、蜱是一類具有頑強生命力并對環(huán)境適應性強的體表寄生蟲。是世界第二大生物傳播媒介，能夠傳播多種疾病，可感染動物和人類。在世界范圍內廣泛存在，對人類自身健康、動物養(yǎng)殖業(yè)和自然環(huán)境帶來嚴重危害，每年造成巨大的經濟損失。當前主要的滅蜱方法有生物防治、化學藥物防治、植物源防治、人工防治等，最普遍最主要的防治方法是化學藥物防治。長期的化學藥物使用，使蜱的某些基因發(fā)生突變而導致耐藥性，并且化學藥物的殘留對自然環(huán)境和人畜的危害也在不斷地加重。為了能夠快速

2、、準確、高效的檢測出蜱的耐藥性，避免化學藥物的濫用和減少因化學藥物造成的蜱耐藥性引起的經濟損失，指導臨床合理用藥，本實驗探索建立了快速檢測蜱耐藥性基因的實時熒光定量PCR檢測方法。主要研究的內容和結果如下:
　　1、通過對實驗室保存的微小牛蜱的陽性基因組克隆，構建普通PCR方法所需要的陽性標準質粒。通過序列比對設計出普通PCR檢測方法和實時熒光定量PCR檢測方法所需要的引物和探針。并提取300份來自湖南、甘肅等地的血紅扇頭蜱、青海

3、血蜱、長角血蜱的基因組作為待測樣品。篩選特異性引物和探針，并與普通PCR方法進行敏感性比對。
　　2、構建實時熒光定量PCR的陽性標準質粒，成功建立蜱鈉通道耐藥性基因的TaqMan探針實時熒光定量PCR的檢測方法。對定量PCR的反應條件和體系進行不斷優(yōu)化，得到較好的擴增效率和線性相關性。并與感染梨形蟲的蜱基因組進行特異性試驗，顯示此方法的特異性較好。陽性檢測結果與普通PCR相比，其敏感性是普通PCR的1000倍，表明此方法的敏感性

4、較好。并使用不同濃度梯度的標準陽性質粒進行組內重復性試驗和組間重復性試驗，結果顯示組內重復性變異系數Ct值均小于5％，組間的變異系數均小于10％,表明此方法的重復性、穩(wěn)定性較好。
　　3、使用本實驗建立的實時熒光定量PCR檢測方法對來自湖南芷江血紅扇頭蜱、甘肅臨潭青海血蜱、甘肅永靖長角血蜱的300份基因組進行檢測。按照TaqMan探針法的陽性標準在300份樣品中共檢測到263份樣品含有鈉通道耐藥性基因，陽性率為87.67％。蜱種內

5、的陽性分布分別為湖南芷江微小牛蜱的陽性率為8734％(69/79)，湖南芷江血紅扇頭蜱的陽性率為8750％(63/72)，甘肅臨潭青海血蜱的陽性率為92.31％(60/65)，甘肅永靖長角血蜱的陽性率為8452％(71/81)。使用普通PCR檢測出來的陽性率為47.0％，使用本實驗所建立的實時熒光定量PCR檢測方法檢測出來的陽性率為8767％陽性符合率為100％。普通PCR檢測為陰性的樣品中有110份使用熒光定量PCR檢測為陽性，從而證