分子嵌合MHC-I基因小鼠骨髓造血干細(xì)胞模型的建立及體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建分子嵌合造血干細(xì)胞,體外探討它對(duì)T細(xì)胞增殖能力的影響,為研究分子嵌合誘導(dǎo)移植免疫耐受奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:①采用RT-PCR方法獲取供體C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因H-2Db,通過(guò)雙酶切、定向克隆技術(shù)將H-2Db亞克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒pMSCVneo,通過(guò)Lipofectamine2000與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以獲得攜帶H-2Db基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。②應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離法分選受體BALB/

2、c小鼠骨髓造血干細(xì)胞。③將攜帶H-2Db的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組；以熒光實(shí)時(shí)定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別在mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組造血干細(xì)胞H-2Db表達(dá)情況。④受體BALB/c小鼠輸注造血干細(xì)胞后7天,取脾細(xì)胞做為反應(yīng)細(xì)胞,與來(lái)自供體C57BL/6小鼠脾細(xì)胞的刺激細(xì)胞行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),MTT法檢測(cè)各組T細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果:①成功獲取H-2Db基因,構(gòu)建的質(zhì)

3、粒pMSCVneo-H-2Db經(jīng)限制性雙酶切檢測(cè)和測(cè)序分析,結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。②質(zhì)粒pMSCVneo-H-2Db經(jīng)包裝后,獲得了攜帶H-2Db基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。③成功體外分選及培養(yǎng)受體BALB/c小鼠骨髓造血干細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34陽(yáng)性細(xì)胞可達(dá)(35.60±2.19)％。④與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比,轉(zhuǎn)染構(gòu)建質(zhì)粒組H-2Db基因mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)

4、粒組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。⑤單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)顯示,轉(zhuǎn)染構(gòu)建質(zhì)粒組刺激指數(shù)較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組明顯降低(P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組之間刺激指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論:①淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離法可成功從小鼠骨髓細(xì)胞中分離造血干細(xì)胞。②攜帶H-2Db基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)染受體BALB/c小鼠骨髓造血干細(xì)胞,且感染后H-2Db基因可穩(wěn)定表達(dá)。