應(yīng)用單細胞技術(shù)研究小鼠造血干細胞發(fā)生.pdf

1、造血干細胞是一群具有自我更新能力和血液系統(tǒng)多系分化潛能的細胞。作為造血發(fā)育過程中的重要事件，造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）起源一直受到廣泛關(guān)注。 HSC發(fā)生具有時間窗短、數(shù)量稀少、無特異性表面標(biāo)志的特點而使得HSC起源研究變得異常困難。我們的工作首先利用多維度實驗條件探索將OP9-DL1共孵育后移植實驗體系提高至單細胞水平；利用大量分選后系列移植實驗（使用超過1200只移植受體）篩選了特異性表面標(biāo)志

2、組合，和單細胞OP9-DL1共孵育后移植實驗，成功對HSC發(fā)育早期兩類造血干細胞前體（pre-HSC），即type1 pre-HSC（T1 pre-HSC）和type2 pre-HSC（T2 pre-HSC）實現(xiàn)了>30％的高純度分離，基本過程是：我們通過多種表面標(biāo)志篩選確定CD201能特異性識別所有功能型 T1pre-HSC，為確認加入 CD201富集后的群體中所含有的功能型 Pre-HSC的頻率，我們先后嘗試了劑量為3細胞和單個細胞

3、孵育后移植實驗，16周后的嵌合情況檢測結(jié)果分別顯示超過80%和30%的受體產(chǎn)生了造血重建，受體的多個造血器官的嵌合情況檢測和二次移植證實了這群細胞具有明確的體內(nèi)各系分化潛能和自我更新潛能。利用3細胞和單細胞移植實驗結(jié)果，我們通過limited dilution統(tǒng)計學(xué)方法計算出現(xiàn)有的T1 pre-HSC表型細胞群體內(nèi)含有真正功能型的Pre-HSC的頻率約為1/2.3；我們利用了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序挖掘T2 pre-HSC具有富集能力的特異性表

4、面標(biāo)志：主成分分析和未經(jīng)高純度富集的T2 pre-HSC群體中內(nèi)皮和造血相關(guān)基因表達情況分析顯示，此前被用于高純度富集T1 pre-HSC的表面標(biāo)志CD201可能同樣能夠被用來富集T2 pre-HSC，隨后對含T2 pre-HSC的新群體進行了3-細胞和單細胞的孵育后移植實驗，結(jié)果顯示超過80%和30%的受體獲得了長期多系造血重建；二次移植結(jié)果體現(xiàn)他們體內(nèi)自我更新能力完善。通過limited dilution分析可得出這群T2 pre-

5、HSC群體內(nèi)的功能型的Pre-HSC的純度大約是1/2.1。至此，T2 pre-HSC也首次成功的被高純度分離。
　　隨后，我們對T1 pre-HSC和T2 pre-HSC群體、內(nèi)皮細胞（endothelial cell， EC）、E12/14胎肝（fetal liver，F(xiàn)L）中的成熟型HSC（即E12 HSC和E14 HSC）共5群HSC發(fā)育過程中的代表性階段的細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序；通過對高通量測序數(shù)據(jù)的挖掘，我們發(fā)現(xiàn)，在

6、5個群體連續(xù)發(fā)育的過程中，他們在轉(zhuǎn)錄活性、階段特異性表達基因、轉(zhuǎn)錄因子、表面標(biāo)志、信號通路和細胞周期等方面呈現(xiàn)多樣性和階段性的分子表達特征。
　　非監(jiān)督系統(tǒng)性聚類分析（Unsupervised hierarchical clustering analysis）和主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果呈現(xiàn)了較為明顯的發(fā)育上EC-T1 pre-HSC-T2 pre-HSC-E12/14HSC

7、的連續(xù)性。Monocle分析結(jié)果也顯示了HSC的基本發(fā)育過程。我們根據(jù)各組細胞的轉(zhuǎn)錄組分子表達水平進行了階段差異性基因分析，結(jié)果顯示在 EC-T1 pre-HSC轉(zhuǎn)變過程基因的上調(diào)或者下調(diào)現(xiàn)象最為活躍，暗示著內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化過程中進行大量的轉(zhuǎn)錄活動；而 E12 HSC-E14 HSC階段上下調(diào)變化的基因最少，提示兩類細胞在發(fā)育上的相似性。GO term分析和聚類分析顯示部分血管生成相關(guān)基因存在明顯的階段特異性表達，這些基因在HSC發(fā)育的5

8、個階段中的基因數(shù)目和單細胞中基因的表達水平均呈現(xiàn)出 EC-T1 pre-HSC過程中上升，隨后逐漸下降的整體趨勢。5類細胞動靜脈相關(guān)基因的表達譜分析顯示Pre-HSC保留了部分動脈基因的表達，但幾乎不表達靜脈基因，暗示pre-HSC可能來源于動脈內(nèi)皮，支持HSC動脈起源理論。隨后，我們根據(jù)基因在不同階段的表達趨勢的變化特征和PCA分析結(jié)果挖掘了一類具有相似表達變化趨勢的基因（被命名為模式基因，pattern gene）。若干HSC相關(guān)轉(zhuǎn)

9、錄因子均被發(fā)現(xiàn)表達于所有的T1 pre-HSC；此外，T1 pre-HSC還表達若干紅系特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子。Pre-HSC和HSC群體還不同程度的表達曾被報道與造血祖細胞系相關(guān)的多個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和重編程相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。我們通過對測序數(shù)據(jù)的挖掘確定了表面分子CD47可能對HSC多個發(fā)育階段具有持續(xù)識別作用，繼而利用系列移植／孵育后移植實驗發(fā)現(xiàn)幾乎所有胚胎期AGM區(qū)內(nèi)HSC相關(guān)群體（E10.5 pre-HSC和E11.5 HSC）和具有產(chǎn)生H

10、SC潛能的內(nèi)皮細胞均表達CD47。通過對比Pre-HSC、Pre-HSC相近群體（不具備pre-HSC潛能）和成體骨髓中HSC的基因表達特征，我們挖掘到了pre-HSC的98個標(biāo)志基因。其中包含了曾被報道通過結(jié)合受體Tie2發(fā)揮調(diào)控骨髓HSC微環(huán)境（HSC niche）靜息狀態(tài)的分泌性細胞因子Angiopoietin1（Angpt1）、G protein偶聯(lián)受體的膜蛋白分子（Gpr56, Vipr1和Vipr2）與細胞增殖與造血遷移有關(guān)

11、的調(diào)控因子Fgfr3。此外，對細胞周期相關(guān)基因在Pre-HSC群體內(nèi)的表達譜分析顯示，Pre-HSC呈現(xiàn)明顯的相對靜息和增殖活躍特征，功能實驗證實Pre-HSC部分處于G0期，另一部分處于SG2M期，提示部分Pre-HSC具有增殖活躍的內(nèi)在特征，與后續(xù)的造血干細胞數(shù)量急劇增加密切相關(guān)。通過GSEA（gene set enrichment analysis）方法比對KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and

12、Genomes）數(shù)據(jù)庫進行信號通路方面的分析，結(jié)果顯示多個信號通路在HSC發(fā)生過程中呈現(xiàn)活躍的變化。T1 pre-HSC（相比EC群體） 顯著富集Fc gamma R和Fc epsilon RI介導(dǎo)的細胞吞噬等細胞膜-骨架協(xié)作關(guān)聯(lián)調(diào)控（membrane-cytoskeleton- coupled processes），與此前報道對含有 HSC的AGM區(qū)細胞進行芯片分析的結(jié)果類似。本研究中的5類群體中，對比EC與后續(xù)4類HSC相

13、關(guān)群體可以明確富集糖酵解過程（glycolysis），這與曾被報道成年骨髓腔內(nèi)靜息狀態(tài)下的HSC大部分處于低氧環(huán)境中（hypoxic niches）的結(jié)論一致。此外，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）過程中的NADH脫氫酶和三磷酸酶（ATPases）也被顯著富集在 T1 pre-HSC中，暗示線粒體有氧呼吸（mitochondrial aerobic respiration）在T1 pre-HSC階段處于高

14、度活化狀態(tài)。該過程不僅能高效產(chǎn)能，還利于氨基酸和脂肪代謝（facilitate amino acid and fatty acid metabolism）。我們還發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路（mammalian target of rapamycin）被高度富集在T1 pre-HSC群體中（相比EC）。
　　上述多個角度的功能學(xué)驗證證實單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性與潛在價值?？傊谠煅l(fā)育過程中，我們的研究為清晰了解造血干細胞起源，以至