應(yīng)用單細(xì)胞技術(shù)研究小鼠造血干細(xì)胞發(fā)生.pdf

1、造血干細(xì)胞是一群具有自我更新能力和血液系統(tǒng)多系分化潛能的細(xì)胞。作為造血發(fā)育過程中的重要事件，造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）起源一直受到廣泛關(guān)注。 HSC發(fā)生具有時間窗短、數(shù)量稀少、無特異性表面標(biāo)志的特點而使得HSC起源研究變得異常困難。我們的工作首先利用多維度實驗條件探索將OP9-DL1共孵育后移植實驗體系提高至單細(xì)胞水平；利用大量分選后系列移植實驗（使用超過1200只移植受體）篩選了特異性表面標(biāo)志

2、組合，和單細(xì)胞OP9-DL1共孵育后移植實驗，成功對HSC發(fā)育早期兩類造血干細(xì)胞前體（pre-HSC），即type1 pre-HSC（T1 pre-HSC）和type2 pre-HSC（T2 pre-HSC）實現(xiàn)了>30％的高純度分離，基本過程是：我們通過多種表面標(biāo)志篩選確定CD201能特異性識別所有功能型 T1pre-HSC，為確認(rèn)加入 CD201富集后的群體中所含有的功能型 Pre-HSC的頻率，我們先后嘗試了劑量為3細(xì)胞和單個細(xì)胞

3、孵育后移植實驗，16周后的嵌合情況檢測結(jié)果分別顯示超過80%和30%的受體產(chǎn)生了造血重建，受體的多個造血器官的嵌合情況檢測和二次移植證實了這群細(xì)胞具有明確的體內(nèi)各系分化潛能和自我更新潛能。利用3細(xì)胞和單細(xì)胞移植實驗結(jié)果，我們通過limited dilution統(tǒng)計學(xué)方法計算出現(xiàn)有的T1 pre-HSC表型細(xì)胞群體內(nèi)含有真正功能型的Pre-HSC的頻率約為1/2.3；我們利用了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序挖掘T2 pre-HSC具有富集能力的特異性表

4、面標(biāo)志：主成分分析和未經(jīng)高純度富集的T2 pre-HSC群體中內(nèi)皮和造血相關(guān)基因表達(dá)情況分析顯示，此前被用于高純度富集T1 pre-HSC的表面標(biāo)志CD201可能同樣能夠被用來富集T2 pre-HSC，隨后對含T2 pre-HSC的新群體進(jìn)行了3-細(xì)胞和單細(xì)胞的孵育后移植實驗，結(jié)果顯示超過80%和30%的受體獲得了長期多系造血重建；二次移植結(jié)果體現(xiàn)他們體內(nèi)自我更新能力完善。通過limited dilution分析可得出這群T2 pre-

5、HSC群體內(nèi)的功能型的Pre-HSC的純度大約是1/2.1。至此，T2 pre-HSC也首次成功的被高純度分離。
　　隨后，我們對T1 pre-HSC和T2 pre-HSC群體、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell， EC）、E12/14胎肝（fetal liver，F(xiàn)L）中的成熟型HSC（即E12 HSC和E14 HSC）共5群HSC發(fā)育過程中的代表性階段的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序；通過對高通量測序數(shù)據(jù)的挖掘，我們發(fā)現(xiàn)，在

6、5個群體連續(xù)發(fā)育的過程中，他們在轉(zhuǎn)錄活性、階段特異性表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄因子、表面標(biāo)志、信號通路和細(xì)胞周期等方面呈現(xiàn)多樣性和階段性的分子表達(dá)特征。
　　非監(jiān)督系統(tǒng)性聚類分析（Unsupervised hierarchical clustering analysis）和主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果呈現(xiàn)了較為明顯的發(fā)育上EC-T1 pre-HSC-T2 pre-HSC-E12/14HSC

7、的連續(xù)性。Monocle分析結(jié)果也顯示了HSC的基本發(fā)育過程。我們根據(jù)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分子表達(dá)水平進(jìn)行了階段差異性基因分析，結(jié)果顯示在 EC-T1 pre-HSC轉(zhuǎn)變過程基因的上調(diào)或者下調(diào)現(xiàn)象最為活躍，暗示著內(nèi)皮向造血轉(zhuǎn)化過程中進(jìn)行大量的轉(zhuǎn)錄活動；而 E12 HSC-E14 HSC階段上下調(diào)變化的基因最少，提示兩類細(xì)胞在發(fā)育上的相似性。GO term分析和聚類分析顯示部分血管生成相關(guān)基因存在明顯的階段特異性表達(dá)，這些基因在HSC發(fā)育的5

8、個階段中的基因數(shù)目和單細(xì)胞中基因的表達(dá)水平均呈現(xiàn)出 EC-T1 pre-HSC過程中上升，隨后逐漸下降的整體趨勢。5類細(xì)胞動靜脈相關(guān)基因的表達(dá)譜分析顯示Pre-HSC保留了部分動脈基因的表達(dá)，但幾乎不表達(dá)靜脈基因，暗示pre-HSC可能來源于動脈內(nèi)皮，支持HSC動脈起源理論。隨后，我們根據(jù)基因在不同階段的表達(dá)趨勢的變化特征和PCA分析結(jié)果挖掘了一類具有相似表達(dá)變化趨勢的基因（被命名為模式基因，pattern gene）。若干HSC相關(guān)轉(zhuǎn)

9、錄因子均被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于所有的T1 pre-HSC；此外，T1 pre-HSC還表達(dá)若干紅系特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子。Pre-HSC和HSC群體還不同程度的表達(dá)曾被報道與造血祖細(xì)胞系相關(guān)的多個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和重編程相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。我們通過對測序數(shù)據(jù)的挖掘確定了表面分子CD47可能對HSC多個發(fā)育階段具有持續(xù)識別作用，繼而利用系列移植／孵育后移植實驗發(fā)現(xiàn)幾乎所有胚胎期AGM區(qū)內(nèi)HSC相關(guān)群體（E10.5 pre-HSC和E11.5 HSC）和具有產(chǎn)生H

10、SC潛能的內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)CD47。通過對比Pre-HSC、Pre-HSC相近群體（不具備pre-HSC潛能）和成體骨髓中HSC的基因表達(dá)特征，我們挖掘到了pre-HSC的98個標(biāo)志基因。其中包含了曾被報道通過結(jié)合受體Tie2發(fā)揮調(diào)控骨髓HSC微環(huán)境（HSC niche）靜息狀態(tài)的分泌性細(xì)胞因子Angiopoietin1（Angpt1）、G protein偶聯(lián)受體的膜蛋白分子（Gpr56, Vipr1和Vipr2）與細(xì)胞增殖與造血遷移有關(guān)

11、的調(diào)控因子Fgfr3。此外，對細(xì)胞周期相關(guān)基因在Pre-HSC群體內(nèi)的表達(dá)譜分析顯示，Pre-HSC呈現(xiàn)明顯的相對靜息和增殖活躍特征，功能實驗證實Pre-HSC部分處于G0期，另一部分處于SG2M期，提示部分Pre-HSC具有增殖活躍的內(nèi)在特征，與后續(xù)的造血干細(xì)胞數(shù)量急劇增加密切相關(guān)。通過GSEA（gene set enrichment analysis）方法比對KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and

12、Genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路方面的分析，結(jié)果顯示多個信號通路在HSC發(fā)生過程中呈現(xiàn)活躍的變化。T1 pre-HSC（相比EC群體） 顯著富集Fc gamma R和Fc epsilon RI介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬等細(xì)胞膜-骨架協(xié)作關(guān)聯(lián)調(diào)控（membrane-cytoskeleton- coupled processes），與此前報道對含有 HSC的AGM區(qū)細(xì)胞進(jìn)行芯片分析的結(jié)果類似。本研究中的5類群體中，對比EC與后續(xù)4類HSC相

13、關(guān)群體可以明確富集糖酵解過程（glycolysis），這與曾被報道成年骨髓腔內(nèi)靜息狀態(tài)下的HSC大部分處于低氧環(huán)境中（hypoxic niches）的結(jié)論一致。此外，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）過程中的NADH脫氫酶和三磷酸酶（ATPases）也被顯著富集在 T1 pre-HSC中，暗示線粒體有氧呼吸（mitochondrial aerobic respiration）在T1 pre-HSC階段處于高

14、度活化狀態(tài)。該過程不僅能高效產(chǎn)能，還利于氨基酸和脂肪代謝（facilitate amino acid and fatty acid metabolism）。我們還發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路（mammalian target of rapamycin）被高度富集在T1 pre-HSC群體中（相比EC）。
　　上述多個角度的功能學(xué)驗證證實單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性與潛在價值。總之，在造血發(fā)育過程中，我們的研究為清晰了解造血干細(xì)胞起源，以至