小鼠胚胎頭部-造血干細(xì)胞發(fā)育的系統(tǒng)性研究.pdf

1、造血干細(xì)胞是不可或缺的，它為整個(gè)生命體提供不同階段、所有類型的血細(xì)胞。造血干細(xì)胞的發(fā)育起源，包括位點(diǎn)、時(shí)間、調(diào)控機(jī)制等，長期以來廣受關(guān)注。眾所周知，AGM區(qū)是小鼠胚內(nèi)唯一的造血干細(xì)胞發(fā)生位點(diǎn)。然而，既往研究發(fā)現(xiàn)去除AGM區(qū)之外的胚胎體細(xì)胞仍然能夠重建成年受體的造血系統(tǒng)，提示胚內(nèi)可能還存在其他未知的造血位點(diǎn)。
　　本研究擬通過多種手段明確小鼠胚胎頭部的造血干細(xì)胞潛能和命運(yùn)。我們通過體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):E10.5時(shí)，移植1.7-2.5個(gè)

2、胚胎量的AGM區(qū)細(xì)胞，大約30％(14/40)的受體長期重建（＞16周），嵌合率46.6％±22.4％。而移植頭部細(xì)胞，12％(5/40)的受體長期重建，嵌合率57.2％±22.9％。但移植循環(huán)血細(xì)胞后，均未檢測到嵌合陽性信號。E11.5時(shí)，頭部細(xì)胞移植后，40％(8/20)的受體長期重建，嵌合率54.6％±23.8％，而AGM區(qū)60％(9/15)受體長期重建，嵌合率47.9％±20.9％。同時(shí)，通過各系嵌合以及二次移植明確E10.5和

3、E11.5的頭部含有真正的造血干細(xì)胞，能多向分化和自我更新。通過流式分選后移植，發(fā)現(xiàn)頭部造血干細(xì)胞富集于CD34+c-Kit+細(xì)胞群。
　　我們利用流式技術(shù)對E9.5-E11.5小鼠胚胎頭部和AGM區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)均含有相當(dāng)比例的CD34+c-Kit+、CD41+c-Kit+、CD45+c-Kit+細(xì)胞。同時(shí)，我們也利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測造血、內(nèi)皮相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E10.5頭部的Scl、P2-Runx1、GATA2的轉(zhuǎn)錄水平是

4、相應(yīng)AGM區(qū)的1.5、1.6、2.3倍，而Tie2、CD144表達(dá)水平相當(dāng)。在Tie2+以及CD31+c-Kit+細(xì)胞群中，無論E10.5還是E11.5，頭部細(xì)胞Scl、P2-Runxl、GATA2的表達(dá)水平均與AGM類似。
　　繼而，我們通過原位染色、流式分析、純化內(nèi)皮細(xì)胞體外誘導(dǎo)和內(nèi)皮細(xì)胞命運(yùn)示蹤考察小鼠胚胎頭部的內(nèi)皮細(xì)胞是否具有生血潛能。首先我們采用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)E10.5的頭部緊貼動脈內(nèi)皮層有CD31+的造血樣細(xì)胞，或成

5、簇或散在。通過流式分析發(fā)現(xiàn)，E10.5頭部的CD31+c-Kithigh比例為0.063％-0.113％，稍低于AGM區(qū)(0.088％-0.157％)。其次，通過流式分選獲得頭部內(nèi)皮細(xì)胞（CD31+CD41-CD45Ter119-），與OP9共培養(yǎng)后可產(chǎn)生CD45+的造血細(xì)胞和CD19+的B細(xì)胞，與AGM相似。應(yīng)用可誘導(dǎo)的VE-cadherin-Cre;tdTomato小鼠模型發(fā)現(xiàn)，頭部細(xì)胞產(chǎn)生的一些造血簇共表達(dá)紅色熒光蛋白和CD45，

6、即tdTomato+CD45+，表明內(nèi)皮生血活動的發(fā)生，與AGM區(qū)類似。流式分析確認(rèn)tdTomato+細(xì)胞中的大部分為CD45+。相反，該現(xiàn)象在循環(huán)血細(xì)胞并未發(fā)現(xiàn)。
　　SP-A-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠模型可特異性標(biāo)記腦組織而非其它位點(diǎn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，適合用于追蹤腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的造血命運(yùn)。首先我們將E12.5的SP-A-Cre;ROSA-LacZ小鼠胚胎進(jìn)行LacZ染色，相應(yīng)的頭部切片中，發(fā)現(xiàn)在動脈內(nèi)皮層和動脈管腔內(nèi)的造血細(xì)胞有LacZ

7、陽性信號，一些LacZ陽性的血細(xì)胞可能是通過出芽的方式由內(nèi)皮細(xì)胞層產(chǎn)生。類似的陽性信號在AGM區(qū)和胎肝中并未發(fā)現(xiàn)。
　　我們也通過原代細(xì)胞的流式分析和體外誘導(dǎo)考察SP-A-Cre;ROSA-LacZ胚胎頭部細(xì)胞的造血能力。E13.5的SPA-Cre;ROSA-LacZ頭部CD31+內(nèi)皮細(xì)胞中，10.5％為FDG+，而CD45+的造血細(xì)胞中，4.6％為FDG+。頭部的Tie2+細(xì)胞與OP9共培養(yǎng)之后，CD31+內(nèi)皮細(xì)胞中20％為FD

8、G+，CD45+造血細(xì)胞中8.4％為FDG+，造血祖細(xì)胞CD45+c-Kit+中，12.3％為FDG，B細(xì)胞(B220+CD19+)中，27.6％為FDG+。這表明:小鼠胚胎的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞具有原位生血和體外造血的能力。
　　最后，我們對不同年齡的SP-A-Cre;ROSA-LacZ、SP-A-Cre;ROSA-EYFP小鼠進(jìn)行檢測以評估腦血管內(nèi)皮細(xì)胞對成體造血系統(tǒng)的生理貢獻(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)，出生后2周的SP-A-Cre;ROSA-La

9、cZ小鼠的骨髓，富集造血干細(xì)胞的LSK(LinSca-1+c-Kit+)亞群中，LacZ陽性的細(xì)胞比例較低，1.1％-1.3％。4周齡小鼠的骨髓中，在富集造血干細(xì)胞效率更高的亞群，即LSKCD48-CD150+，LacZ陽性細(xì)胞的比例為4.2％-4.5％。我們也考察了4-6周齡的SP-A-Cre;ROSA-EYFP小鼠造血各系的情況，發(fā)現(xiàn)骨髓的LSKCD48-CD150+細(xì)胞中，EYFP陽性細(xì)胞的比例為5.9％-7.7％。骨髓和外周血各