造血干細(xì)胞聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞共移植治療鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]
　　 研究異基因骨髓造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)共移植治療MRL/lpr狼瘡小鼠的臨床療效和移植前后淋巴細(xì)胞亞群的演變，監(jiān)測嵌合體的形成，觀察共移植對排斥反應(yīng)的影響。
　　 [方法]
　　 (1)分離Balb/C小鼠骨髓來源MSC：分離雄性Balb/C小鼠(4周齡，20g)股骨、脛骨，沖出骨髓后

2、采用貼壁培養(yǎng)法分離、擴(kuò)增、傳代、凍存、復(fù)蘇MSC，并流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原標(biāo)志。(2)分離Balb/C小鼠骨髓來源HSC：沖出雄性Balb/C小鼠(4周齡，20g)骨髓后使用免疫磁珠分選Lin-CD117+HSC，并流式細(xì)胞術(shù)檢測Lin-CD117+HSC的純度。(3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：已發(fā)病的MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為5組。對照組：以生理鹽水代替干細(xì)胞尾靜脈輸注；移植組：每只共接受1×106個(gè)干細(xì)胞，按HSC與MSC的比例不同共分為4

3、組：HSC：MSC=1:5組、HSC：MSC=1:1組、HSC：MSC=5:1組和HSC：MSC=1:0組(單純HSC移植組)。(4)移植后實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周，每天觀察小鼠的一般情況：進(jìn)食、毛發(fā)、體重、精神等；移植前后進(jìn)行尿蛋白定性、定量測定；檢測外周血血肌酐、血常規(guī)；流式細(xì)胞術(shù)檢測移植前后T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+CD4+、CD3+CD8+)的變化；采用RT-PCR對移植后MRL/lpr小鼠嵌合體進(jìn)行分析；光鏡觀察移植后受體的腎病理變化以及移

4、植排斥反應(yīng)。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)MSC采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，5～7天后貼壁細(xì)胞可鋪至培養(yǎng)皿皿底80％～90％。傳至5、6代時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，為均勻的單一細(xì)胞，呈紡錘樣，流式細(xì)胞術(shù)CD44+，Sca-1+，CD34-，CD117-。(2)成功自小鼠骨髓中分離純化出Lin-CD117+細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測，Lin-CD117+HSC陽性率分選前為16.95％，分選后達(dá)91.82％。(3)在移植后8周內(nèi)：①移植

5、后2周內(nèi)，各移植組小鼠的一般情況，如進(jìn)食、精神狀態(tài)、體重、毛發(fā)與對照組大致相同，但移植后第3周開始，各移植組小鼠逐漸出現(xiàn)體重減輕、精神狀態(tài)欠佳、食欲下降，不同程度的脫毛等現(xiàn)象；②移植后各組均能獲得較好的造血系統(tǒng)重建；③HSC：MSC=1:1組、HSC：MSC=5:1組、HSC：MSC=1:0組血肌酐較對照組下降(P<0.05)；④各組尿蛋白移植后較前上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間比較顯示HSC：MSC=5:1移植組尿蛋白低

6、于對照組及單純HSC移植組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；⑤T淋巴細(xì)胞亞群檢測：移植后各移植組CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞較移植前高(P<0.05)；對照組CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞較前降低(P<0.05)；組間對照提示對照組與HSC：MSC=5:1組的CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間對照提示CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑥嵌合體檢測：移植后8周嵌合

7、率HSC：MSC=5:1組呈升高趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；⑦腎臟病理HE、PASM、Masson染色觀察：移植前MRL/lpr小鼠呈狼瘡腎炎性變，對照組系膜細(xì)胞肥大增生、基底膜增厚、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤明顯，各干細(xì)胞移植組移植后病理改變較前好轉(zhuǎn)，以HSC：MSC=5:1組明顯。
　　 [結(jié)論]
　　 HSC聯(lián)合骨髓MSC共移植可以緩解鼠SLE近期以HSC：MSC=5:1移植組效果較為明顯，遠(yuǎn)期療效有待