H-2半相合小鼠雙供體造血干細(xì)胞移植模型的建立及相關(guān)研究.pdf

1、研究目的：建立一種新的單倍體造血干細(xì)胞移植模式，即H-2半相合小鼠雙供體外周血造血干細(xì)胞移植模型。該新的移植模式可達(dá)到造血重建、供體長期完全穩(wěn)定植入、GVHD程度輕、避免細(xì)菌、真菌及病毒等嚴(yán)重感染并發(fā)癥、死亡率低的目的。
　　研究內(nèi)容1、依據(jù)文獻(xiàn)報道及本實(shí)驗(yàn)室成熟的實(shí)驗(yàn)方法，建立小鼠H-2半相合經(jīng)典清髓性外周血造血干細(xì)胞移植模型，并鑒定該模型；2、在本實(shí)驗(yàn)室既往已經(jīng)建立的實(shí)驗(yàn)動物模型的基礎(chǔ)上，降低預(yù)處理強(qiáng)度，采用TBI2Gy預(yù)處理

2、方案，輸注等量的兩種單倍體相合、單倍體相合聯(lián)合完全不相合的供鼠G-CSF動員的外周血造血干細(xì)胞，并加大輸注的細(xì)胞總量，建立H-2半相合小鼠雙供體外周血造血干細(xì)胞移植模型，觀察該模型的安全性和可行性，并與經(jīng)典移植組相對照，比較造血重建規(guī)律、供體植入特點(diǎn)、GVHD發(fā)生率和GVHD致死率、生存率等情況；3、在此基礎(chǔ)上，嘗試在無預(yù)處理?xiàng)l件下，建立H-2半相合小鼠雙供體外周血造血干細(xì)胞移植模型，并檢測受鼠移植后各組織器官各細(xì)胞亞群中的供體植入率，

3、以及外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化等。
　　研究方法：經(jīng)典清髓移植組：供鼠選擇雄性C57，從移植前5天開始供鼠每天接受rhG-CSF（100μg/kg）的動員，皮下注射，間隔12h，2次/日，共5天之后提取脾單個核細(xì)胞（spMNC）。受鼠選擇雌性CB6F1（雌性BALB/c和雄性C57的雜交一代），以8Gy TBI為預(yù)處理方案，TBI使用60Coγ射線，鈷源距離為76cm，劑量率1.03Gy/min，受鼠經(jīng)TBI照射2h之內(nèi)回輸經(jīng)G-C

4、SF動員的供體脾單個核細(xì)胞（spMNC)，細(xì)胞輸注總量是3×107。移植后從小鼠一般狀況、造血恢復(fù)、供體植入、GVHD發(fā)生情況、死亡情況、臟器病理等方面鑒定該模型；雙供體移植組：受鼠也選擇CB6F1，降低預(yù)處理強(qiáng)度至TBI2Gy（較經(jīng)典移植降低了4倍）， TBI使用60Coγ射線，鈷源距離為76cm，劑量率1.03Gy/min，受鼠經(jīng)TBI照射2h之內(nèi)回輸經(jīng)G-CSF動員的兩種供體來源的spMNC共12×107（各6×107），移植物總

5、細(xì)胞量是經(jīng)典移植組的4倍。在保證雄性C57做半相合供者不變的前提下，為探討另一個半相合供者BALB/c的性別以及第三方同種異基因全不相合供者C3H對植入的影響，我們將雙供體移植組分為三組：A組=雄性C57+雌性BALB/c， B組=雄性C57+雄性BALB/c，C組=雄性C57+雄性C3H。觀察雙供體移植各組的造血重建、供體植入、GVHD發(fā)生情況及生存情況等。與經(jīng)典移植組對比，證實(shí)雙供體移植模型的可行性和安全性，并優(yōu)化新的雙供體單倍體移

6、植模型；在此基礎(chǔ)上，嘗試在無預(yù)處理?xiàng)l件下，建立H-2半相合小鼠雙供體移植模型，觀察小鼠一般狀況、造血、植入、GVHD、死亡、臟器病理等情況，并檢測受鼠移植后各組織器官和各亞群中的供體嵌合率等。
　　研究結(jié)果：首先，本實(shí)驗(yàn)成功建立了小鼠H-2半相合清髓性外周血造血干細(xì)胞經(jīng)典移植模型。其次，在上述實(shí)驗(yàn)動物模型的基礎(chǔ)上，降低預(yù)處理強(qiáng)度（TBI由8Gy降低到2Gy），通過輸注雙供體造血干細(xì)胞，加大移植物細(xì)胞總量（由3×107增加到12×1

7、07），不使用免疫抑制劑，不做GVHD預(yù)防，成功建立了小鼠H-2半相合雙供體外周血造血干細(xì)胞移植模型。
　　具體而言，經(jīng)典移植組和雙供體移植各組的而對比結(jié)果有：①經(jīng)典移植組出現(xiàn)嚴(yán)重造血抑制，WBC<1×109/L持續(xù)3-5d；A、B、C各組未出現(xiàn)造血抑制（WBC3×109/L)；②經(jīng)典移植組快速植入，1w達(dá)到外周血完全植入；A、B、C各組1w混合植入，2w達(dá)完全植入。③經(jīng)典移植組移植后34天GVHD發(fā)生率及GVHD致死率均為100

8、％。雙供體移植組：34天總體GVHD發(fā)生率及致死率分別是49.6%、50%(P＜0.01, P＜0.05)，50天分別60.4%和81.2%，50天總體存活率50.9%。④雙供體移植組中，兩種供者在受鼠體內(nèi)的供體植入率有差別。雙供體移植A組和B組中， C57雄性供者在植入上占優(yōu)勢，2w之內(nèi)受鼠體內(nèi)可檢測到少量雌性BALB/c供體成分，2w之后受鼠體內(nèi)C57供者完全植入。而C組受鼠在早期（4d）時檢測供體植入率即無C3H供體成分,2w時也

9、可達(dá)到C57供者完全植入。⑤雙供體移植A、B、C各組的造血恢復(fù)、供體植入率、GVHD發(fā)生率均無差異，B和C組GVHD致死率略少于A組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,P＞0.05)；B組OS略優(yōu)于C組及A組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,P＞0.05)。
　　無預(yù)處理?xiàng)l件下，也成功建立了H-2半相合小鼠雙供體外周血造血干細(xì)胞移植模型，受鼠外周血細(xì)胞三系緩慢降低，但可自行恢復(fù)，完全未發(fā)生造血抑制。外周血細(xì)胞亞群（除外CD8+、CD11

10、b+細(xì)胞）短暫受抑制，但可逐漸恢復(fù)正常。不做GVHD預(yù)防，卻未見臨床GVHD發(fā)生，組織臟器病理切片顯示雙供體組臟器損傷程度明顯輕于經(jīng)典移植組。受鼠外周血、各組織器官、各細(xì)胞亞群移植后均經(jīng)過1m時間的混合嵌合才轉(zhuǎn)化為完全嵌合，且無預(yù)處理?xiàng)l件下，雙供體移植組小鼠移植后獲得的供體嵌合體為多系嵌合體。
　　研究結(jié)論：預(yù)處理強(qiáng)度和免疫抑制劑不再是供體植入的必備條件。①以2Gy的TBI為預(yù)處理方案，較經(jīng)典移植預(yù)處理強(qiáng)度（TBI8Gy）降低了4

11、倍，輸注等量的兩種半相合供鼠細(xì)胞，細(xì)胞總量是經(jīng)典移植細(xì)胞量的4倍，移植后不使用免疫抑制劑，無GVHD防治措施，結(jié)果移植后無明顯抑制、造血重建快、植入穩(wěn)定、GVHD明顯減輕、長期存活明顯增加，成功建立了H-2半相合小鼠雙供體外周血造血干細(xì)胞移植模型，與臨床雙份臍血移植類似，雙供體移植模型最終只有優(yōu)勢供體植入；②在無預(yù)處理?xiàng)l件下，成功建立了小鼠H-2半相合雙供體外周血造血干細(xì)胞移植模型：受鼠造血細(xì)胞及外周淋巴細(xì)胞亞群短暫抑制但可逐漸恢復(fù)正常