移植前輸注供體細(xì)胞促進(jìn)單倍體相合造血干細(xì)胞植入的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）已經(jīng)成為治愈血液系統(tǒng)惡性疾病最有效的手段之一。但由于生物種系及個(gè)體間的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompability complex，MHC）存在差異，同種異體移植時(shí)將產(chǎn)生雙向排斥反應(yīng)，即移植物抗宿主（graft versus host，GVH）和宿主抗移植物（host versus graft，HVG）反

2、應(yīng)。由于單倍體相合供受者間人類白細(xì)胞分化抗原（Human leukocyte antigen，HLA）差異顯著，移植排斥反應(yīng)重，移植前往往需要大劑量的放化療清除宿主免疫系統(tǒng)，預(yù)防排斥、促進(jìn)植入，同時(shí)需去除移植物中的T細(xì)胞以減輕移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD），并且加大輸注的供者造血干細(xì)胞數(shù)量以促進(jìn)植入。非清髓性造血干細(xì)胞移植（nonmyeloablative hematopoietic st

3、em cell transplantation，NST）由于移植前放化療強(qiáng)度降低，移植相關(guān)毒性減輕，越來越符合現(xiàn)代治療學(xué)的要求。然而非清髓性單倍體或不相合造血干細(xì)胞移植（mismatched hematopoietic stem cell transplantation,mis-HSCT）一方面預(yù)處理強(qiáng)度降低，另一面供受者主要組織相容性抗原不合，常導(dǎo)致移植物排斥，移植后嵌合率低，甚至植入失敗。如何促進(jìn)植入一直是非清髓性單倍體相合造血干細(xì)

4、胞移植的重點(diǎn)研究課題之一。如何在非清髓或減低毒性的（reduced intensity conditioning，RIC）前提下進(jìn)一步降低預(yù)處理強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)單倍體相合造血干細(xì)胞的植入，對于臨床移植具有重要意義。因其不僅保留了非清髓性單倍體相合造血干細(xì)胞移植的長處，進(jìn)一步降低了移植相關(guān)毒性，解決了相合供者來源不足的問題，同時(shí)弊棄了其短處，即移植排斥反應(yīng)大。
　　目前已知，宿主體內(nèi)的T細(xì)胞是介導(dǎo)同種異體排斥反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞，其清除或者

5、誘導(dǎo)免疫無能對于促進(jìn)植入具有重要意義。去除或抑制供者同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞可以明顯降低GVHD的發(fā)生率，表明同種異體反應(yīng)性細(xì)胞的去除對于減低異體排斥反應(yīng)確實(shí)可以減輕異體排斥。因而我們設(shè)想，通過去除受者體內(nèi)同種異體反應(yīng)性 T的方法減輕宿主對供者細(xì)胞的排斥，促進(jìn)植入。阿糖胞苷為抗嘧啶類抗代謝藥，主要作用于S期的細(xì)胞，分裂活躍的細(xì)胞對其尤為敏感。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)免疫細(xì)胞接觸抗原64h時(shí)細(xì)胞毒作用達(dá)到峰值，我們通過移植前輸注供鼠細(xì)胞誘導(dǎo)宿主 T細(xì)胞產(chǎn)

6、生針對供鼠的同種異體反應(yīng)，并在細(xì)胞免疫達(dá)到峰值之前利用阿糖胞苷將宿主體內(nèi)這種同種反應(yīng)性 T細(xì)胞清除，這樣宿主體內(nèi)淋巴細(xì)胞池針對宿主同一抗原的免疫能力相對耗竭，短時(shí)間內(nèi)接觸同一抗原，將產(chǎn)生免疫耐受，從而促進(jìn)供體細(xì)胞植入。
　　第一部分非清髓性單倍體相合骨髓移植小鼠模型的建立
　　目的:建立小鼠非清髓性單倍體相合骨髓移植模型,為研究移植前輸注供體細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受提供研究平臺。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組2組。以CB6

7、F1雌性小鼠為受鼠，移植前一天予450cGy全身照射（TBI）后，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組移植0d輸注C57BL/6雄性小鼠骨髓有核細(xì)胞5×107/只，對照組不予移植。監(jiān)測受鼠造血恢復(fù)、檢測供鼠Y染色體上性別決定基因(SRY)，以及外周血供體細(xì)胞尤其 CD3+細(xì)胞嵌合狀態(tài)，同時(shí)觀察小鼠急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versus-host disease，aGVHD）的發(fā)生情況。
　　結(jié)果:對照組及實(shí)驗(yàn)組小鼠均未見小鼠死亡

8、，各組小鼠均未見明顯aGVHD表現(xiàn)，移植后30d內(nèi)白細(xì)胞值基本恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)組小鼠SRY基因在移植后14d、30d、60d時(shí)經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測，結(jié)果均陽性，供鼠外周血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞嵌合率移植后14d、30d、60d時(shí)分別為23.8％±4.6%、36.9%%±13.7%、19.4%±7.5%vs49.9%±3.6%、53.2%±7.6%、54.4%±4.8%vs6

9、7.6%±3.1%、51.6%±4.3%、56.9%±2.9%，其中 CD3+細(xì)胞嵌合率分別為4.4%±4.6%、21.2%±6.4%、54.4%±4.1%。
　　結(jié)論:450cGyTBI的非清髓性預(yù)處理方案，可以誘導(dǎo)受鼠免疫耐受、供體骨髓細(xì)胞植入，嵌合率處于中低水平混合嵌合狀態(tài)。
　　第二部分移植前輸注供體細(xì)胞促進(jìn)單倍體相合造血干細(xì)胞植入的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察移植前輸注供體細(xì)胞，能否誘導(dǎo)宿主免疫耐受、促進(jìn)供體骨髓

10、細(xì)胞植入。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為移植前輸注脾細(xì)胞、骨髓細(xì)胞組和對照組3組。移植前-3d經(jīng)尾靜脈予受鼠雌性CB6F1輸注供鼠雄性C57BL/6脾細(xì)胞或骨髓細(xì)胞3×107,24h和48h后分別通過腹腔注射阿糖胞苷0.75g/㎏，移植前一天予450cGy全身照射（TBI），移植當(dāng)天輸注供鼠骨髓有核細(xì)胞5×107/只。監(jiān)測受鼠存活、白細(xì)胞恢復(fù)、外周血供鼠 CD3+細(xì)胞嵌合狀態(tài)及 GVHD的發(fā)生。
　　結(jié)果:各組分別有兩只小鼠死亡，并表

11、現(xiàn)不同程度GVHD。移植前輸注脾細(xì)胞組和對照組白細(xì)胞恢復(fù)中位時(shí)間相當(dāng)，為17d（12d~37d），輸注骨髓細(xì)胞組恢復(fù)時(shí)間稍慢，中位時(shí)間為22d（22d~22d）。移植前輸注供體脾細(xì)胞組及對照組供鼠 CD3+細(xì)胞嵌合率相當(dāng)，均達(dá)到完全供者型嵌合，+30d時(shí)移植前輸注脾細(xì)胞組供鼠源 CD3+細(xì)胞比例達(dá)93.5%±4.8%，明顯高于輸注骨髓細(xì)胞組（P<0.05），+60d時(shí)，輸注骨髓細(xì)胞組供體細(xì)胞嵌合率上升為87.2%±7.4%，與對照組嵌合