中國南荻全基因組BAC文庫的構(gòu)建.pdf

1、芒屬植物( Miscanthus，俗稱芒草)是最具開發(fā)潛力的重要草本纖維素能源植物。近年來，芒草遺傳學(xué)、基因組學(xué)研究及其優(yōu)異種質(zhì)材料的開發(fā)利用成為國際上生物學(xué)研究的熱點領(lǐng)域。芒草起源于東南亞地區(qū)，在我國具有豐富的遺傳資源，其具有獨特的生物學(xué)特性：草本多年生、生長速度快、高效的水分和氮肥利用率、更高的光合效能和生物產(chǎn)量；抗逆性強、適用范圍廣、資源豐富多樣；耕作粗放、水肥要求低、生產(chǎn)成本投入低；根系發(fā)達、益于水土保持、生態(tài)環(huán)境友好、易儲藏運

2、輸。這些特征使它在眾多的能源植物中脫穎而出，成為世界上最具開發(fā)潛力的纖維素能源作物，同時也賦予了它重要的科學(xué)研究價值。
　　中國南荻(Miscanthus lutarioriparia)是我國的特有種類，它資源豐富、分布廣泛、抗寒耐瘠、高光合效能；南荻基因組大而復(fù)雜，約為2500Mb，相當(dāng)于玉米和人類基因組大小(Armuganathan K., Earle ED,1991)。大片段基因組 BAC文庫是開展基因組學(xué)、物理圖譜構(gòu)建、重

3、要基因的克隆等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)?，F(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和方法的不斷創(chuàng)新和完善，大大提高了復(fù)雜植物基因組的 BAC文庫構(gòu)建效率和質(zhì)量，基因組 BAC文庫構(gòu)建和文庫篩選技術(shù)已相當(dāng)成熟?；蚪M BAC文庫構(gòu)建和基于 BAC文庫物理圖譜進行基因克隆等技術(shù)方法已經(jīng)廣為使用。
　　本文以中國南荻M013作為實驗材料，以pHZAUBAC1為載體，用HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切DN A，經(jīng)過載體的制備、高質(zhì)量大片段DN A的獲得、部分酶切最佳條件的確定

4、、兩次大片段選擇以及連接轉(zhuǎn)化等過程，成功構(gòu)建了中國南荻BAC文庫。
　　本實驗結(jié)果表明，幼嫩的葉片提取的細胞核污染少、得率高，大小均集中在700kb以上；大片段DNA的最佳酶切條件為每1/2plug使用3U的Hind III37℃酶切10min；回收后的大片段DNA與載體以10:1的質(zhì)量比連接轉(zhuǎn)化效率最高。
　　本實驗得到的BAC文庫共包含130560個克隆，以單克隆的形式保存在340塊384孔細菌培養(yǎng)板中，并構(gòu)建了超級池。

5、對隨機挑取的100個單克隆檢測的結(jié)果顯示：插入片段多集中于90-120kb之間，平均大小為106kb，插入片段大小分布比較集中，均一性好?？蛰d率為1％。該BAC文庫覆蓋了南荻基因組的5.6倍。隨機挑取的5個克隆經(jīng)過100代左右的繁殖，仍能穩(wěn)定地遺傳，沒有出現(xiàn)丟失或變異，說明 BAC克隆的穩(wěn)定性良好。文庫覆蓋率、插入片段大小、穩(wěn)定性均能滿足物理圖譜構(gòu)建、基因圖位克隆、基因定位等后續(xù)工作的需求。
　　本研究是首次對我國纖維素生物質(zhì)能源