四個玉米及其野生材料BAC基因組文庫的構(gòu)建和分析.pdf

1、玉米是世界上最重要的農(nóng)作物之一，它不但為人類提供食物，同時也是優(yōu)質(zhì)的飼料，更是多種工業(yè)制品如酒精，淀粉的原料。育種家更是培育出了眾多特用玉米，大大擴(kuò)展了玉米的用途。遺傳學(xué)和基因組學(xué)中的很多現(xiàn)象如轉(zhuǎn)座子，表觀遺傳和雜種優(yōu)勢等都首先在玉米中被發(fā)現(xiàn)。玉米的基因組表現(xiàn)出復(fù)雜和多樣化的特點，是其它大型植物基因組測序和基因組進(jìn)化的模式植物。世界上玉米的種質(zhì)資源非常豐富，它們的野生近緣材料，大芻草和摩擦禾更是包含眾多優(yōu)良性狀及生物和非生物抗性的基因?qū)?/p>

2、庫。開發(fā)和解讀玉米及其野生材料的基因組資源的第一步是構(gòu)建大片段基因組的細(xì)菌人工染色體文庫(bacterialartificialchromosomelibrary,BACLibrary)，構(gòu)建高質(zhì)量的物理圖譜，進(jìn)而得到全基因組序列。還可以同時將篩選到的包含重要農(nóng)藝性狀基因或基因家族的大片段直接進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化來研究基因的功能?？紤]到開發(fā)玉米及其野生資源的重要性以及BAC文庫在基因組學(xué)研究中的重要作用，本研究構(gòu)建了四個玉米及其野生材料的BAC

3、文庫，并對這些文庫進(jìn)行了質(zhì)量檢測。對兩個野生玉米材料進(jìn)行了初步分析。
　　四個玉米及其野生材料分別是自交系鄭58和昌7-2，大芻草Parviglumis(Zeamaysssp:Parviglumis)，摩擦禾Tripsacum（Tripsacumdactyloides）。鄭58和昌7-2是中國種植面積最廣的雜交種鄭單958的雙親，包含了眾多優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因。Parviglumis是栽培玉米的祖先，TripsacumL.在玉蜀黍族里

4、面距離玉蜀黍?qū)儆H緣關(guān)系最近，也和玉米的起源有關(guān)。Parviglumis和Tripsacum都是巨大的基因?qū)殠?，它們代表著還未開發(fā)的與農(nóng)作物改良相關(guān)的遺傳資源。本實驗針對以上四種材料的研究結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建了兩個玉米自交系（鄭58和昌7-2）以及兩個玉米野生材料（Parviglumis和Tripsacum）的BAC文庫。這四個BAC文庫都是用HindⅢ部分酶解，連接到pIndigoBAC536-SBAC載體上。鄭58的BAC文

5、庫包含148，992個克隆，平均插入片段為144kb，細(xì)胞器DNA污染率為0.55％，基因組覆蓋度為8.4倍。昌7-2的BAC文庫包含145，920個克隆，平均插入片段為139kb，細(xì)胞器DNA污染率為0.58％，基因組覆蓋度為8.0倍。Parviglumis的BAC文庫包含100，608個克隆，平均插入片段為148kb，細(xì)胞器DNA污染率為0.31％，基因組覆蓋度為5.5倍。Tripsacum的BAC文庫包含128，256個克隆，平均

6、插入片段為139kb，細(xì)胞器DNA污染率為0.26％，基因組覆蓋度為4.7倍。
　　2.選擇了12個玉米B73的單拷貝基因，分別分布在玉米的10條染色體上。用該12個基因作探針，對Parviglumis和TripsacumBAC文庫進(jìn)行篩選。12個基因在兩個野生玉米BAC文庫中都篩選到了陽性克隆，說明這兩個野生玉米文庫可以用來篩選目的基因。兩個玉米自交系鄭58和昌7-2的BAC文庫因為擁有更高的基因組覆蓋度，篩選到目的基因的可能性

7、更大。
　　3.對4個位點，adh1，adh2，tb1，ba1上下游基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用這些基因探針對Parviglumis和TripsacumBAC文庫進(jìn)行篩選。一共篩選到120個克?。≒arviglumis）和159個克?。═ripsacum）。對這些克隆通過fingerprinting進(jìn)行contig拼裝，以備后續(xù)測序分析。
　　4.對來自兩個野生玉米文庫的442個克隆進(jìn)行末端測序，有88％的末端序列測序成功。對1

8、2個基因探針篩選到的陽性克隆通過fingerprinting進(jìn)行contig拼裝。Parviglumis文庫中共有64個克隆拼裝成了20個contigs，Tripsacum文庫中共有85個克隆拼裝成了27個contigs。用一個contig表示一個位點來估算基因組的覆蓋度，ParviglumisBAC文庫的基因組覆蓋度為3.2倍，而TripsacumBAC文庫的基因組覆蓋度為3.1倍。
　　5.我們嘗試?yán)肂AC末端序列將Parv

9、iglumisBAC文庫中篩選到的陽性克隆錨定到玉米B73的參考序列上。Parviglumis中有102個克隆的BESs在B73參考序列上有錨定位點。成功測得202條BESs，有196條BESs在B73參考序列上有錨定位點。有70個克隆可以錨定到參考序列上。其中有18個克隆能夠拼裝成contig，并且錨定到預(yù)期的位置。一共有9個contig可以錨定到參考序列上。
　　6.我們嘗試?yán)肂AC末端序列將TripsacumBAC文庫中篩

10、選到的陽性克隆錨定到玉米B73參考序列上。Tripsacum中有104個克隆的BESs在B73參考序列上有錨定位點。成功測得229條BESs，有150條BESs在B73參考序列上有錨定位點。有22個克隆可以錨定到參考序列上。其中有5個克隆能夠拼裝成contig，并且錨定到預(yù)期的位置。一共有3個contig可以錨定到參考序列上。
　　7.分析能夠錨定到B73參考序列上的adh1contig。通過用Ⅰ-SceⅠ酶切BAC克隆，用脈沖場