牦牛瘤胃微生物元基因組BAC文庫(kù)的篩選與分析.pdf

1、反芻動(dòng)物瘤胃是公認(rèn)的木質(zhì)纖維素高效降解的天然反應(yīng)器,對(duì)瘤胃微生物的研究成為開發(fā)生物能源的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。其研究手段已經(jīng)從傳統(tǒng)的依賴分離培養(yǎng)從瘤胃中獲得木質(zhì)纖維素降解菌,并對(duì)降解菌中的木質(zhì)纖維素降解酶逐一分析,發(fā)展到通過基因組/元基因組技術(shù),直接從瘤胃中發(fā)現(xiàn)獲得大量新的木質(zhì)纖維素降解酶基因/基因簇,進(jìn)而探討其降解的分子機(jī)理。元基因組BAC(Bacterialartificialchromosome)文庫(kù),具有能夠容納大插入片段的優(yōu)勢(shì),近幾年

2、來(lái)受到廣泛關(guān)注,通過構(gòu)建大片段的元基因組BAC文庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行篩選有可能獲得大量新的基因/基因簇。建立了木質(zhì)纖維素降解酶高通量篩選平臺(tái),可在3種不同底物的篩選平板上一次完成96個(gè)克隆的脂肪酶、木聚糖酶、纖維素酶和酯酶的活性篩選。采用該方法從已構(gòu)建的牦牛瘤胃元基因組BAC文庫(kù)的9600個(gè)克隆中篩選獲得脂肪酶陽(yáng)性克隆60個(gè)(0.625％),木聚糖酶陽(yáng)性克隆123個(gè)(1.28%),纖維素酶陽(yáng)性克隆156個(gè)(1.625%),酯酶陽(yáng)性克隆101個(gè)(

3、1.05%);其中具有2種酶活性的克隆79個(gè),3種酶活性的克隆11個(gè),表明文庫(kù)中存在大量木質(zhì)纖維素降解酶基因/基因簇。對(duì)4個(gè)木聚糖酶陽(yáng)性克隆的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)存在多種糖苷水解酶基因和調(diào)控基因,還發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能的新木聚糖酶基因簇。為驗(yàn)證該基因簇的功能,對(duì)其中的部分基因在大腸桿菌中進(jìn)行了克隆、表達(dá)、蛋白純化及酶活性測(cè)定,研究結(jié)果證實(shí)該基因簇的ORF33基因、ORF34基因分別編碼降解木聚糖主鏈的內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶/木糖苷酶,為進(jìn)