純培養(yǎng)微生物全基因組深度測序研究.pdf

1、微生物是包括細(xì)菌、病毒、真菌以及一些小型原生動(dòng)物等在內(nèi)的一大類生物群體,它個(gè)體微小,卻與人類生活密切相關(guān)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展及生物醫(yī)學(xué)水平的提高,人們逐漸了解到是遺傳信息決定了生物體的生命特征,包括外部形態(tài)、生命活動(dòng)等,而基因組是這些遺傳信息的攜帶者。因此全基因組序列的研究將大大有助于揭示生命的本質(zhì)和探索生命的起源。微生物全基因組測序?qū)τ谡J(rèn)識微生物的生物學(xué)特征,研究病原體微生物的遺傳變異、毒力基因和致病性等具有重要意義。

2、>　　本研究基于Ion Torrent高通量測序技術(shù),探索了獲得純培養(yǎng)微生物全基因組序列的方法。革蘭氏染色法把細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩大類,這兩類菌的細(xì)胞壁厚度及成分不同,因此破壁方法不同,革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁比較厚,成分比較復(fù)雜,在破壁過程中需要加入溶菌酶。經(jīng)過多次探索我們找到了一種同時(shí)適用于兩種細(xì)菌的快速簡單的試劑盒,并對其進(jìn)行了優(yōu)化,用該試劑盒分別提取了34株革蘭氏陽性菌,7株革蘭氏陰性菌的基因組,之后,用鳥槍法及mat

3、e-pair方法建庫并用Ion PGM進(jìn)行測序,最后用Newbler軟件進(jìn)行拼接、組裝,得到細(xì)菌全基因組序列,進(jìn)行RAST注釋,序列比對等生物信息學(xué)分析。
　　由于抗生素的濫用,致病菌耐藥性越來越嚴(yán)重,細(xì)菌性疾病對人類健康造成極大威脅,噬菌體制劑作為一種新的治療手段倍受人們關(guān)注,而且隨著測序技術(shù)的不斷迅速發(fā)展,越來越多的噬菌體被測序,使得噬菌體在分子生物學(xué)研究進(jìn)程中扮演著越來越重要的角色,我們采用蛋白酶K/SDS方法分別提取了27

4、株噬菌體基因組,然后進(jìn)行了Ion Torrent文庫構(gòu)建及上機(jī)測序,最后測序數(shù)據(jù)用軟件進(jìn)行拼接,得到了噬菌體全基因組序列并注釋。
　　動(dòng)物病毒是指感染動(dòng)物和人類細(xì)胞并在其中進(jìn)行繁殖的病毒。我們以11株禽流感病毒(RNA病毒)和1株腺病毒(DNA病毒)為對象,研究動(dòng)物病毒全基因組深度測序的方法,首先,分別將其細(xì)胞培養(yǎng)液離心,過濾去除宿主細(xì)胞,DNase和RNase消化去除宿主游離核酸,超濾濃縮病毒,提取核酸,然后進(jìn)行一步法擴(kuò)增、MD

5、A擴(kuò)增、混合引物擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增等擴(kuò)增方法的探索,最后將擴(kuò)增產(chǎn)物純化,建庫,上機(jī)測序,獲得全基因組序列,進(jìn)行遺傳進(jìn)化等分析。
　　綜上所述,本研究總共測定了41株純培養(yǎng)細(xì)菌的全基因組序列,包括34株革蘭氏陽性細(xì)菌和7株革蘭氏陰性細(xì)菌,還測定了39株純培養(yǎng)病毒全基因組序列,包括27株噬菌體、11株禽流感病毒(RNA病毒)和1株腺病毒(DNA病毒)。建立了對不同類型純培養(yǎng)微生物采用不同的核酸提取、文庫構(gòu)建方法及擴(kuò)增方法,對這些微生物的