山羊瘤胃宏基因組文庫蛋白酶的篩選分離.pdf

1、瘤胃是反芻動物的一個重要消化器官，其中含有豐富的微生物資源，主要包括細菌、真菌、原生動物等多種微生物，約90％左右為未培養(yǎng)微生物。瘤胃中蛋白質(zhì)的降解提供了反芻動物40％的氮源，因此瘤胃具有復(fù)雜的蛋白酶系，以完成蛋白質(zhì)的降解。與多糖降解酶相比，瘤胃中蛋白質(zhì)降解酶類的研究相對較少，是一個有待挖掘的良好資源。因此，本研究利用宏基因組技術(shù)，從山羊瘤胃中篩選具有新穎特性的蛋白酶類。
　　 實驗室前期構(gòu)建了山羊瘤胃宏基因組文庫。本論文利用功

2、能驅(qū)動篩選策略，以脫脂牛奶作底物篩選文庫，獲得了兩個陽性克隆:R-P-1和R-P-2。以酪蛋白為底物的SDS-PAGE蛋白酶譜分析，發(fā)現(xiàn)R-P-1能產(chǎn)生1條蛋白酶活性帶，R-P-2則能產(chǎn)生3條蛋白酶降解帶。對陽性克隆插入序列進行末端測序分析發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與GenBank的已有序列一致性較低，顯示其新穎性。對R-P-1和R-P-2進行全序列測序。經(jīng)注釋，在R-P-1上發(fā)現(xiàn)了1個絲氨酸蛋白酶編碼基因(1SP1)，在R-P-2上發(fā)現(xiàn)了4個絲

3、氨酸蛋白酶編碼基因(2SP1-2SP4)和1個肽酶編碼基因(2P)。另外這些蛋白質(zhì)序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列相比，同源性較低。經(jīng)過構(gòu)建蛋白質(zhì)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)各蛋白酶與同家族的已知蛋白酶進化關(guān)系較遠，獨立成分支，進一步說明各蛋白酶的新穎性。蛋白酶組分的亞細胞定位預(yù)測顯示各蛋白酶大都定位在胞外或細胞外膜，這些有利于它們對胞外蛋白質(zhì)分子進行降解。R-P-2上4個絲氨酸蛋白酶基因，其編碼的蛋白酶都屬于Peptidase_S8家族，然而在序列上又存在

4、著一定的差異，推測其功能上具有一定互補性，以協(xié)同高效地完成胞外復(fù)雜蛋白質(zhì)的降解。
　　 以陽性克隆R-P-2的培養(yǎng)液制備粗酶樣品，測定顯示其中的蛋白酶具有較廣的pH耐受范圍。粗酶液經(jīng)60％飽和硫酸銨沉淀、Q-XL柱離子交換層析和Superdex7510/300GL柱分子篩層析后，SDS-PAGE檢測顯示初步分離到兩個具有蛋白酶活性的組分RP2a和RP2b，LC-MS/MS鑒定RP2a為2SP1，RP2b為2SP3。為進一步開展酶