式根島海綿宏基因組文庫活性物質研究.pdf

1、海綿是次級活性代謝產(chǎn)物的豐富和重要來源。很多海綿次級代謝產(chǎn)物是由海綿的共生菌產(chǎn)生的。但是，大多數(shù)的海綿微生物在實驗條件下仍然無法培養(yǎng)。功能宏基因組學可以不經(jīng)過任何培養(yǎng)或分離步驟，直接從環(huán)境樣品中提取基因組DNA，來開發(fā)未培養(yǎng)環(huán)境微生物。由于海綿微生物具有化學和生物多樣性，海綿宏基因組文庫將是一種很有潛能的資源，可用來探索獨特的活性小分子物質及其對應的未知功能基因。因此，本論文構建了式根島海綿（Discodermia calyx）的宏基因

2、組文庫，對其進行功能篩選，檢測到三株不同的活性克隆。對活性克隆進行后續(xù)的化學和序列信息研究，從液體培養(yǎng)液中鑒定出4個卟啉類化合物（1-4）及其對應的功能基因，3個脂肪酸化合物（5-7）及其相關的功能基因，8個吲哚類化合物（8-15）；從平板培養(yǎng)（固體培養(yǎng)）提取物中檢測得到1個酰胺類化合物（16），分離出11個環(huán)二肽類化合物（17-27）。主要研究結果如下：
　?、俪晒⒘耸礁鶏u海綿宏基因組文庫，并從中得到3株不同的陽性克?。嚎瓜?/p>

3、狀芽孢桿菌（B. cereus）活性克隆pDC113，棕紅色克隆pDC112和pDC114。
　　②從棕紅色克隆pDC112和pDC114檢測分離到四個紅色色素：糞卟啉III鋅螯合物（1）、糞卟啉III（2）、原卟啉IX鋅螯合物（3）和原卟啉（4）。其中1是主要色素，其結構由1H NMR，13C NMR，1H-1H COSY，HMQC，HMBC，HRMS，UV數(shù)據(jù)確定。對克隆pDC112的插入DNA序列進行測定分析，鑒定出由40.

4、639 kb基因編碼的31個假定的開放閱讀框（ORF）。其中4個ORFs參與卟啉類化合物生物合成：細胞色素c型生源蛋白（261 aa），谷酰胺tRNA還原酶（hemA，420 aa），膽色素原脫氨酶（hemC，322 aa）和膽色素原合酶（hemB，322 aa）。pDC114的序列分析結果表明，其37.753 kb序列編碼的32個假定ORFs中，含有5個ORFs編碼的蛋白與卟啉類化合物C5生物合成途徑中形成線狀或環(huán)狀四吡咯的必需酶有很

5、近的同源關系：前咕啉-4C（11）-甲基轉移酶（175 aa），鈷胺生物合成酶（391 aa），前咕啉-3B甲基酶（358 aa），hemA（463 aa），谷氨酸-1-半醛2，1-氨基變位酶（hemL，428 aa）。hemA基因同時存在這2個克隆中，說明hemA可能是合成卟啉類化合物的一個必需的基因。卟啉類衍生物具有重要的醫(yī)藥和食療價值，為了工程上使用E. coli生產(chǎn)卟啉類化合物及其衍生生物，從式根島海綿繼續(xù)開發(fā)其獨特的生物合成酶

6、基因，是有價值的。
　?、蹚目咕寺DC113的異源表達培養(yǎng)液中分離檢測到3個β-羥基脂肪酸：3-羥基棕櫚酸（5），3-羥基肉豆蔻酸（6）和3-羥基月桂酸（7）。5具有中等程度的抗菌活性（MIC，μg/mL）：B. cereus（6.25）和白色念珠菌（C. albicans，12.5）。對pDC113的插入DNA序列進行分析，結果表明其43.32 kb序列編碼42個假定的ORFs。其中23個假定的ORFs（共24.813 kb

7、）編碼的蛋白參與脂肪酸和脂質A的生物合成，與細菌脂肪酸Ⅱ類合成酶和脂質A生物合成酶有很近的同源關系。6個ORFs編碼的蛋白：脂肪酸/磷脂合成蛋白（plsX，376 aa）、ACP S-丙二酰轉移酶（fabD314 aa）、fabG（253 aa）、?；d體蛋白質（ACP，81 aa）、b-酮脂酰-ACP合成酶II（fabF，417 aa）和b-羥基酰基-ACP脫水酶（fabZ，179 aa），參與細菌Ⅱ型脂肪酸的生物合成。7個ORFs編

8、碼的蛋白：LpxD（344 aa）、LpxA（269 aa）、LpxB（391 aa）、KdtA（434 aa）、LpxK（379 aa）、LpxL（285 aa）和LpxM（285 aa），參與脂質A的生物合成。23個ORFs中的其它ORFs可能是參與脂質A生物合成的跨膜蛋白。脂肪酸和脂質 A的生物合成途徑是抗微生物藥物，尤其是抗耐藥性細菌藥物研發(fā)的很有吸引力的潛在靶點。海綿微生物及其有趣的基因將是這些藥物靶點的獨特來源。
　　

9、④從抗菌克隆pDC113的液體培養(yǎng)提取物的其它活性部位，還分離得到7個吲哚類化合物（8-14），其中12具有很強的抗菌活性。通過對克隆pDC113的序列分析，并沒有明顯發(fā)現(xiàn)它們的功能基因信息。在培養(yǎng)液中加入色胺培養(yǎng)pDC113，以檢測化合物8的產(chǎn)量是否顯著提高時，意外得到一個新的吲哚三聚體化合物15，并且活性（MIC，μg/mL）很好：對B. cereus（<0.78），MSSA（<0.78），C. albicans（6.25）和E.

10、coli（25）都具有抗菌活性，并對小鼠白血病P388具有細胞毒性（IC50，1.52μg/mL）。
　　⑤本實驗也嘗試了平板培養(yǎng)活性克隆pDC112和pDC113，得到與液體培養(yǎng)不同的化合物。從克隆pDC112的平板培養(yǎng)提取物的活性部位中檢測到一個克隆特異性酰胺類化合物16，由于其量少且不穩(wěn)定，只確定了部分結構。從抗菌克隆pDC113的平板培養(yǎng)提取物的活性部位分離鑒定出11個環(huán)二肽類化合物（17-27）。據(jù)目前所知，這些環(huán)二肽化

11、合物是首次從宏基因組文庫分離出來。對pDC113的序列進行分析，結果表明分離的環(huán)二肽類化合物的合成不是通過非核糖體肽類合成酶（NRPS）的途徑，也不同于已知的環(huán)肽類合成酶（CDPSs）的途徑。其很大可能是通過新的基因編碼的新的酶生物合成的。這一結果證明了宏基因組最吸引人的一個理論潛能：提高發(fā)現(xiàn)新基因的機會。
　　本研究對式根島海綿宏基因組文庫進行功能篩選，成功地分離鑒定出27個活性化合物及化合物1-7的有意思的功能基因。研究表明，