奶牛瘤胃微生物元基因組文庫(kù)中脲酶和脂肪酶克隆的篩選與分析.pdf

1、本研究從奶牛瘤胃微生物中篩選得到了脲酶和脂肪酶陽(yáng)性克隆，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，并勾畫了尿素分解菌多樣性，共包括三個(gè)部分： 第一部分：利用脲酶選擇性培養(yǎng)基，從奶牛瘤胃微生物BAC文庫(kù)的15360個(gè)克隆中篩選得到了16個(gè)脲酶克隆。利用酚-次氯酸法對(duì)脲酶克隆的酶活性分析，表明均具有不同的尿素分解能力，酶的活力范圍是30～2466 U/mg。脲酶陽(yáng)性克隆插入片段大約是60 kb，限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切圖譜表明，各個(gè)克隆具有不同DNA

2、片段，其中脲酶U1、U3、U4和U9的最適pH為8．0，最適溫度為60℃。 第二部分：提取16個(gè)脲酶克隆的質(zhì)粒，利用脲酶保守序列ureC引物和細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化E．coli JM109，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。利用Blast程序?qū)⑿蛄信cGenBank和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并使用Mega4．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。4個(gè)脲酶克隆含有脲酶保守序列ureC，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，

3、U1、U5、U13和U15分別屬于Firmicutes，ε-Proteobacteria，β-Proteobacteria和Actinobacteria；7個(gè)脲酶克隆含有16S rDNA，經(jīng)過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析，U1、U3、U7、U10、U11、U12和U14分別屬于Staphylococcus，Shigella，Bacillus，Acinetobacter，Achromobacter，未培養(yǎng)微生物和Bacillus。本研究表明奶牛瘤胃微生物

4、脲酶基因和尿素分解菌具有多樣性的特點(diǎn)。 第三部分：利用含有三油酸甘油酯的脂肪酶選擇性篩選培養(yǎng)基，從奶牛瘤胃微生物元基因組文庫(kù)15360個(gè)克隆中，篩選得到了18個(gè)脂肪酶陽(yáng)性克隆，其插入片段大約為60 kb，并且各個(gè)克隆的插入片段各不一樣。利用p-NPP法對(duì)脂肪酶克隆的脂肪酶活性分析，表明均具有大小不等的脂肪酶活性。底物特異性分析表明Lipase6、Lipase7和Lipase8分別對(duì)C16底物（對(duì)硝基苯棕櫚酸酯）、C12底物（對(duì)硝