湖羊瘤胃微生物Fosmid文庫中內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、從湖羊瘤胃Fosmid文庫的12，704個克隆中，通過剛果紅染色分析獲得16個具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的陽性克隆。根據(jù)陽性克隆透明圈大小從中選取兩個(HF105和HF126)克隆進(jìn)行序列測定。序列測定結(jié)果表明，HF105中含有1個編碼內(nèi)切葡聚糖酶的ORF，編碼359個氨基酸，該蛋白含有一個糖基水解酶家族5(GH5)的結(jié)構(gòu)域(pfam00150)。該結(jié)構(gòu)域與Butyrivibrio crossotus DSM2876的內(nèi)切葡聚糖酶同源性最高，

2、氨基酸序列相似性為72％。HF126中含有1個編碼內(nèi)切葡聚糖酶的ORF，編碼759個氨基酸，該蛋白含有三個結(jié)構(gòu)域，分別為CBM＿4＿9(pfam02018)，CelD-N(pfam02927)和GH9(pfam00759)。其中GH9結(jié)構(gòu)域與Butyrivibrio fibrisolvens16/4的GH9基因序列(CBK74409.1)同源性最高，氨基酸序列相似性為85％。
　　 分別將內(nèi)切葡聚糖酶基因HFec105和HFec

3、126與原核表達(dá)載體pET-30a(+)相連接，導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)構(gòu)建基因工程菌。分別經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h和10h后，菌體破碎離心取上清，點(diǎn)樣于羧甲基纖維素鈉平板，39℃培養(yǎng)3h，經(jīng)剛果紅染色，在平板上可見明顯的透明圈，表明表達(dá)產(chǎn)物EHFec105以及EHFec126都具有羧甲基纖維素酶活性；進(jìn)一步用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析檢測，EHFec105蛋白分子量約為45kDa與推導(dǎo)的融合蛋

4、白分子量一致，EHFec126蛋白分子量在95-130kDa之間，比推到的融合蛋白分子量89kDa稍大。
　　 破碎上清液經(jīng)6×His親和層析純化，分析純化酶HFec105和HFec126對于不同底物的水解活性。結(jié)果顯示，HFec105對CMC底物和β-葡聚糖底物的比活性分別為7.21U/mg和3.89U/mg，最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為6.0；HFec126對CMC底物和β-葡聚糖底物的比活性分別為3.76U/mg和23

5、.39U/mg，最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH為6.0；而兩者對p-NPG、微晶纖維素以及木聚糖均沒有水解作用。
　　 將HFec105基因的成熟肽序列與pGAPZαA載體相連接，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115構(gòu)建重組酵母工程菌GS115-pGAPZαA-HFec105。在YPD培養(yǎng)基中30℃連續(xù)發(fā)酵120h，分別收集48，72，96和120h表達(dá)上清點(diǎn)樣于羧甲基纖維素鈉平板，39℃培養(yǎng)3h，經(jīng)剛果紅染色，平板上可見明顯的透明圈，表