堿性造紙廢液微生物木聚糖酶的基因克隆、表達及相關性質研究.pdf

1、植物細胞壁半纖維素中最具代表性的組分為木聚糖,其可被木聚糖酶水解為低聚木糖和木糖。木聚糖酶在飼料、紙漿造紙、食品、能源及環(huán)境科學等方面有著廣闊的應用前景。而堿性木聚糖酶特有的高pH耐受性,使其在基因工程和工業(yè)應用,特別是造紙生產(chǎn)中,有著重要的理論和實用價值。
　　 堿性環(huán)境中蘊含大量新穎的未培養(yǎng)微生物及可培養(yǎng)未開發(fā)的微生物,為新型酶制劑的開發(fā)提供了寶貴的材料。本論文以采自造紙廠的堿性工業(yè)廢水及活性污泥為實驗材料,采用兩種途徑獲取

2、木聚糖酶資源。一是從環(huán)境基因組中直接進行木聚糖酶基因的克隆表達,以開發(fā)未培養(yǎng)微生物中木聚糖酶基因資源。另一方面采用富集培養(yǎng)的方法從此環(huán)境中分離微生物,并對可培養(yǎng)微生物中木聚糖酶基因進行研究。
　　 根據(jù)木聚糖酶催化保守區(qū)設計簡并引物,利用Touchdown-PCR等技術,直接以堿性的造紙廢液環(huán)境基因組DNA為模板,克隆得到22個木聚糖酶基因片段,進一步通過Tail-PCR方法獲得8個完整的小聚糖酶基因,它們的命名及與已知核苷酸序

3、列的一致性為aws-2x(64％)、aws-3x(52％)、aws-4x(43％)、aws-5x(63％)、aws-6x(48％)、xyn-9(71％)、xyn-11(69％)、xyn-b39(86％),它們中大多數(shù)與已知基因序列一致性較低,具有較好的新穎性。
　　 對其中4個基因aws-2x,aws-4x、aws-5x、xyn-b39進行大腸桿菌異源表達及酶學性質研究,重組蛋白AWS-2X、AWS-4X、AWS-5X、XYN-

4、B39在堿性條件下均表現(xiàn)出較好的耐受性,而在極酸性條件下卻沒有活性。在pH9.0下,AWS-2X可以保持最大活性的50％以上,AWS-4X可以保持30％以上,AWS-5X可以達到70％以上,XYN—B39可以保持80％以上的活性,甚至在pH10.0還可以保持40％的活性,而它們在pH5.0以下均沒有活性。此外,每一個酶具有較為獨特的性質。AWS-2X對于硬木木聚糖的特異性遠高于其它來源木聚糖,對于櫸木木聚糖的活性是燕麥木聚糖活性的2.3

5、倍；AWS-4X是一個單結構域的雙功能木聚糖酶,葡聚糖酶活性可以達到木聚糖酶活性的12.9％；AWS-5X具有很好的金屬離子抗性,10 mM Mg2+和Fe2+對分別對其有1.21和1.12倍的激活作用;XYN-B39是一個多結構域的第十家族木聚糖酶,包括兩個CBM4—9、一個GH10的CD,一個CBM9及三個SLH結構域,通過紙漿漂白實驗分析,XYN-B39可以提高紙漿白度,明顯降低紙漿膏伯值。
　　 除了直接從環(huán)境中克隆基因

6、外,本研究還從堿性造紙廢液中分離得到一株具有較強木聚糖降解能力的菌株,經(jīng)16S rDNA鑒定命名為Paenibacillus sp.12—11。從中克隆得到同一基因簇上的木聚糖酶xyn-7c和xyn-7x。重組酶XYN-7C的最適pH為8.0,其酶蛋白的氨基酸組成、電荷比等特征顯示它可以作為一個很好的堿性木聚糖酶的研究材料。
　　 本研究選擇堿性廢液為研究材料,所得到的木聚糖酶均能在堿性條件下具有較好活性及穩(wěn)定性,而且一般在極酸