1株產(chǎn)堿性木聚糖酶菌株的篩選、產(chǎn)酶條件與酶學性質(zhì)研究及其木聚糖酶基因的克隆表達.pdf

1、半纖維素是僅次于纖維素含量第二豐富的可利用自然資源，其主要成分是木聚糖(xylan)。木聚糖的來源不同，分枝程度不同，其主鏈和支鏈帶有多種不同的取代基團。由于木聚糖結(jié)構(gòu)的復雜性，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成。β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能夠以內(nèi)切方式作用木木聚糖主鏈產(chǎn)生不同長度的木寡糖和少量的木糖，因此它是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。 本試驗采用剛果紅染色的方法篩選出一株耐堿性木聚糖酶高產(chǎn)菌株，

2、對其產(chǎn)酶條件及酶學性質(zhì)進行研究，并通過基因克隆手段得到編碼木聚糖酶的基因，實現(xiàn)該基因在大腸桿菌中的高效表達，整個試驗分三部分進行。 1.根據(jù)水聚糖酶分解木聚糖底物生成的寡糖不能被剛果紅染色，從而在菌落周圍形成透明圈這一特性，對從武漢晨鳴紙廠采集的堿性紙漿進行生孢子處理，根據(jù)不同菌株所形成的透明圈的有無，決定需要復篩的菌株，經(jīng)產(chǎn)酶基本培養(yǎng)基復篩后，篩選到一株堿性木聚糖酶高產(chǎn)菌株，對該菌株進行普通染色、革蘭氏染色、形態(tài)學特征和16S

3、rDNA序列分析，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus.Subtilis)，并且命名為BYG6-6。 2.對其生長條件和產(chǎn)酶條件研究結(jié)果表明，該菌適宜在pH7.0、溫度33℃下生長。為了給菌體提供有效的營養(yǎng)，對培養(yǎng)基中的氮源和碳源進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，應用樺木木聚糖作為碳源、牛肉膏作為氮源的培養(yǎng)基，能夠使細菌很好的生長，并表現(xiàn)良好的產(chǎn)酶能力。 改變木聚糖酶和底物作用時的溫度和pH值，確定該酶的最適值及其耐受性。

4、結(jié)果顯示：該酶最適反應溫度為酶反應的最適溫度為55℃。在65℃時酶活仍有73.07％.證明該酶屬于嗜中溫酶類，不具有高溫耐受性；酶反應最適pH值為6.74，在pH為7.22時剩余木聚糖酶的活力為91.8％，即使反應pH值升高到9.0和10.0時，剩余酶活力仍在70％以上，說明該菌株所產(chǎn)酶具有較強的耐堿性。 3.根據(jù)已經(jīng)報到的枯草芽胞桿菌木聚糖酶基因，設(shè)計特異性引物從BYG6-6基因組中擴增得到一個基因片段，連接到pGEM-T V

5、ector載體上測序得到該基因序列，經(jīng)在線比對分析該基因與已報道的木聚糖酶基因的同源性達到99％以上。借助軟件分析表明：該基因全長642個堿基，基因序列為一個完整的閱瀆框，起始密碼為ATG，終止密碼TAG連續(xù)編碼214個氨基酸，分子大小約為24kDa。 我們利用引物B3-up和B3-down，從高產(chǎn)術(shù)聚糖酶的枯草芽孢桿菌BYG6-6中克隆木聚糖酶基因，接著將其構(gòu)建在表達載體PET-28(a)中，用 Escherichia col