產(chǎn)適冷木聚糖酶菌株的篩選，酶的分離純化、基因克隆和表達以及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、木聚糖是半纖維素的主要成分，是地球上第二大可再生碳源。內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶（EC3．2．1．8）可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖等小分子物質(zhì)，它在生物轉(zhuǎn)化、食品、飼料、醫(yī)藥、造紙等行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，具有廣闊的開發(fā)前景。適冷木聚糖酶指最適酶活溫度20-30℃之間的木聚糖酶，一般來源于兩極和海冰等低溫環(huán)境中的微生物，目前研究的較少。 本文從中國極地研究中心分離得到的147株北極海冰細菌和本實驗室保存的海洋細菌中篩選得到兩株

2、產(chǎn)適冷木聚糖酶的菌株，分別為Pseudoalteromonas elyakovii Bsi20429和Glaciecola mesophila KMM241T，前者為中國極地研究中心分離的海冰細菌，后者購買自德國微生物保藏中心（DSMZ），保藏號為15026T。 經(jīng)過硫酸銨沉淀和陽離子交換層析后，從菌株P(guān)．elyakovii Bsi20429發(fā)酵粗酶液中分離到了一個電泳純的木聚糖酶，分子量約為45 kDa，其最適酶活溫度為30

3、℃，最適酶活pH為8，0。N-端序列測定結(jié)果顯示該酶與來自Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a的木聚糖酶pXyl具有很高的同源性，利用后者的基因序列通過PCR技術(shù)得到了該酶的絕大部分基因序列（1201 bp），比對分析表明該酶與pXyl氨基酸序列具有97％相似性，屬于第八家族木聚糖酶。 利用數(shù)據(jù)庫中已有的來自菌株P(guān)seudoalteromonas atlantica T6c的木聚糖酶基因序列

4、，從G． mesophila KMM241基因組中通過PCR擴增得到了第十家族木聚糖酶基因xynA，序列比對分析表明基因xynA全長1272 bp，編碼423個氨基酸，由一個催化結(jié)構(gòu)域和一個N-端信號肽序列組成。XynA與菌株P(guān)．a(chǎn)tlantica T6c的木聚糖酶氨基酸序列具有97％的相似性，在已報道過的木聚糖酶中，與之相似性最高的是來自Flavobacterium sp． MSY2的木聚糖酶Xynl0，相似性為46％。利用表達載體p

5、ET-22b（+），基因xynA在大腸桿菌BL21（DE3）中成功進行了表達，胞外和胞內(nèi)酶活分別達到1．2 U/ml和0．7 U/ml，通過硫酸銨沉淀和鎳柱親和層析得到了電泳純的重組木聚糖酶XynA的成熟酶，通過N-端測序確定了成熟酶由376個氨基酸組成，分子量約為42 kDa。 對重組酶XynA性質(zhì)進行了詳細研究，該酶最適酶活溫度為30℃，最適酶活pH為7．0，熱穩(wěn)定性差，30℃時半衰期為20 min，變性溫度Tm值為44．

6、5℃。該酶對山毛櫸木聚糖，樺木木聚糖和燕麥木聚糖的水解效率依次降低，不能水解纖維素，淀粉，幾丁質(zhì)，海藻多糖和甘露聚糖。動力學(xué)研究表明XynA在30℃時水解山毛櫸木聚糖的Km值為1．40 mg/ml，Vmax為103．2μmol min-1mg-1，kcat為72 s-1，在40℃時的Km值、Vmax和Kcat分別為0．77 mg/ml，17．33μmol min-1 mg-1和12 s-1。Ca2+、EDTA、Li2+和K+對該酶酶活具

7、有促進作用，Zn2+、Cu2+、Ni+、Sn2+、Co2+、Mn2+、Fe3+、和SDS對XynA酶活具有明顯的抑制作用，并且在10mM時的抑制作用均大于1 mM。XynA對NaCl具有很高的耐受性，在NaCl濃度接近飽和時（4．0 M），仍保留有接近50％的最高酶活。酶解產(chǎn)物分析表明，該酶對山毛櫸木聚糖酶解效率很高，只產(chǎn)生木二糖和木三糖，并且能夠高效酶解四糖以上的木寡糖。這些性質(zhì)表明XynA可能在木寡糖生產(chǎn)和面粉改性等行業(yè)中具有較好的