基于玉米基因組特定BAC跨疊群序列定位Rf3基因.pdf

1、玉米不僅是世界上重要的糧食作物和飼料作物，也是植物遺傳學(xué)研究的重要模式植物。玉米基因組學(xué)研究是分子生物學(xué)的前沿領(lǐng)域，玉米自交系B73全基因組序列草圖的公布大大促進(jìn)了玉米功能基因組學(xué)研究，為研究玉米基因組結(jié)構(gòu)及基因克隆奠定了良好基礎(chǔ)。BAC文庫(kù)的發(fā)展，特別是玉米自交系B73的BAC文庫(kù)的建立，BAC測(cè)序工作及序列的公布，為物理作圖、開發(fā)分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位、基因圖位克隆提供了有效工具。
　　 植物雄性不育是雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，CM

2、S/Rf系統(tǒng)為實(shí)踐中雜交種的生產(chǎn)提供了便利。玉米CMSL/Rf系統(tǒng)是世界上最早應(yīng)用于雜種優(yōu)勢(shì)育種的系統(tǒng)之一。S-CMS是玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育中最大的一組，但育性表現(xiàn)不穩(wěn)定，影響了其在育種中的應(yīng)用?？寺∑浠謴?fù)基因Rf3對(duì)充分發(fā)揮其在雜種優(yōu)勢(shì)中的利用尤為重要。前人已對(duì)Rf3基因進(jìn)行了定位，但目前還無(wú)法滿足圖位克隆的需要。
　　 本研究在本室前期對(duì)玉米S-CMS研究基礎(chǔ)上，以近等基因系S-Mol7Rf3Rf3和S-Mol7Rf3Rf3為

3、材料，結(jié)合SSR、STS分子標(biāo)記開發(fā)技術(shù)，利用Rf3基因區(qū)段的BAC序列信息，在對(duì)此區(qū)域序列進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，對(duì)Rf3基因進(jìn)行精細(xì)定位，篩選與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，建立Rf3的緊密遺傳連鎖圖譜，獲得主要研究結(jié)果如下：
　　 1．利用近等基因系S-Mol7Rf3Rf3和S-Mol7Rf3Rf3構(gòu)建了回交一代BC1F1群體（S-Mol7Rf3Rf3×S-Mol7Rf3Rf3）×N-Mol7Rf3Rf3。對(duì)所有單株進(jìn)行田間育性及花粉鏡

4、檢，二者的結(jié)果一致，且不育株與半不育株比例為2720：2781，符合1：1。在本研究中該育性恢復(fù)性狀是受一對(duì)基因控制的，排除了背景的影響。
　　 2．利用Rf3基因所在2.09bin區(qū)域的標(biāo)記UMC2184、SCARE12M7對(duì)Rf3進(jìn)行初定位，并作為其它標(biāo)記的錨定位點(diǎn)，據(jù)此確定Rf3基因位于跨疊群Contig108中。
　　 3．利用Rep3eat Masker軟件對(duì)Contig108中78個(gè)BAC序列進(jìn)行重復(fù)序列分析

5、，發(fā)現(xiàn)有62.82％為重復(fù)序列。重復(fù)序列中92.62％為逆轉(zhuǎn)座子，而其中LTR數(shù)量最多，占逆轉(zhuǎn)座子的89.29％。LTR中Gypsy/DIRS1占46.46％，Ty1/Copia占39.22％。這一結(jié)果與前人對(duì)玉米基因組結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)基本相符，說(shuō)明通過(guò)對(duì)BAC序列分析，可以對(duì)全基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步了解。
　　 4．利用SSRScan軟件和SSPIT軟件對(duì)不含重復(fù)序列（未屏蔽簡(jiǎn)單重復(fù)序列）的BAC序列進(jìn)行SSR序列分析，共發(fā)現(xiàn)221個(gè)S

6、SR序列，平均約60.0kb就有一個(gè)，與前人研究相符。
　　 5．利用Clemson大學(xué)提供的在線整合服務(wù)平臺(tái)開發(fā)SSR標(biāo)記，共合成了63對(duì)引物，其中有22對(duì)在親本S-Mol7Rf3Rf3和S-Mol7Rf3Rf3間有多態(tài)性，開發(fā)效率為35％。本研究利用其中的9個(gè)SSR標(biāo)記用于Rf3基因的精細(xì)定位，其中最近的為標(biāo)記N7和N8，它們位于Rf3基因兩側(cè)，距Rf3基因均為1.7cM。
　　 6．根據(jù)SSR標(biāo)記初步定位結(jié)果，在目

7、標(biāo)BAC中開發(fā)STS標(biāo)記。將目的區(qū)段分為亞區(qū)，設(shè)計(jì)了153對(duì)引物，其中5對(duì)在親本S-Mol7Rf3Rf3和S-Mol7Rf3Rf3間有多態(tài)性，開發(fā)效率為3.3％，本研究利用其中4對(duì)對(duì)Rf3基因精細(xì)定位，其中標(biāo)記N10、N11與N8共分離，距Rf3基因1.7cM；標(biāo)記N9、N12共分離，與Rf3基因距離為0.7cM。
　　 7．用FGENESH軟件對(duì)BAC序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，用Blastp及InterProScan軟件進(jìn)行基因注釋，

8、共有406個(gè)預(yù)測(cè)基因被注釋，其中有16個(gè)含有PPR結(jié)構(gòu)域，它們位于8個(gè)BAC中。但這8個(gè)BAC中7個(gè)BAC含有的PPR結(jié)構(gòu)域與水稻恢復(fù)基因Rf-1有關(guān)，說(shuō)明此區(qū)域與育性恢復(fù)存在一定的相關(guān)性，且Rf3可能與Rf-1有同源性。另外，發(fā)現(xiàn)Rf3基因定位所在的兩個(gè)BAC中均不含有編碼PPR結(jié)構(gòu)域的基因。對(duì)BAC序列和線粒體基因組進(jìn)行共線性分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)BAC與線粒體基因組高度同源。這一結(jié)果證實(shí)了Rf3基因定位結(jié)果且說(shuō)明建立自交系Mol7的BA