9HRE-hVEGF-,165--Tet-on-Advanced-Ang-1基因雙調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)在心肌細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的： 建立hVEGF165/Ang-1基因雙調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，以rAAV2(2型重組腺病毒相關(guān)病毒)為載體，將9HRE(低氧反應(yīng)元件)調(diào)控的hVEGF165(人血管內(nèi)皮生長因子)及Tet-on-Advanced調(diào)控的Ang-1(血管生長素-1)感染心肌細(xì)胞，通過缺氧、復(fù)氧及加入、撤除Dox(強(qiáng)力霉素)，從核酸和蛋白水平觀察對(duì)轉(zhuǎn)染hVEGF165與Ang-1基因表達(dá)的調(diào)控作用。 方法： 采用磷酸鈣共轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒輔助

2、腺病毒相關(guān)病毒重組系統(tǒng)轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞(human embryo kidney 293 T cells，HEK293T)，制備重組腺病毒相關(guān)病毒(recombine adeno-associated viral，rAAV)，采用氯仿-PEG8000/NaCL-氯仿方法提純r(jià)AAV。采用胰蛋白酶低濃度、分次消化法分離新生Sprague-Dawley(S-D)大鼠心肌細(xì)胞，并進(jìn)行體外無血清培養(yǎng)。將rAAV-9HRE-hVEGF165和

3、rAAV-rtTA-R5-M2、rAAV-TRE-Tight-Ang-1病毒聯(lián)合感染心肌細(xì)胞，并模擬在體的聯(lián)合作用過程。實(shí)驗(yàn)分為8組。(A)rAAV-9HRE-hVEGF16(缺氧)感染組；(B)rAAV-9HRE-hVEGF165、rAAV-rtTA-Rs-M2與rAAV-TRE-Tight-Ang-1(缺氧)聯(lián)合感染組；(C)rAAV-9HRE-hVEGF165、rAAV-rtTA-Rs-M2與rAAV-TRE-Tight-Ang-

4、1(缺氧+DOX)聯(lián)合感染組；(D)rAAV-9HRE-hVEGF165、rAAV-rtTA-Rs-M2與rAAV-TRE-Tight-Ang-1(DOX)聯(lián)合感染組；(E)rAAV-rtTA-Rs-M2與rAAV-TRE-Tight-Ang-1(DOX)感染組；(F)rAAV-9HRE-Laz對(duì)照組，(G)rAAV-rtTA-Rs-M2與rAAV-TRE-Tight-luc對(duì)照組；(H)PBS對(duì)照組。 心肌細(xì)胞免疫熒光染色和W

5、estern blot檢測(cè)hVEGF165和Ang-1蛋白的表達(dá)情況；RT-PCR測(cè)細(xì)胞hVEGF165和Ang-1 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1、三種質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)量分別為，pAAV-H9VEGF165 1.20mg，pAAV-RC 1.50mg，pHelper 2.60mg。HEK293T培養(yǎng)及傳代后生長狀態(tài)良好。病毒有效稀釋倍數(shù)為20倍，病毒轉(zhuǎn)染率為87％。 2、新生大鼠心肌細(xì)胞貼壁生長，呈梭形或多角形，95

6、％細(xì)胞可見自律搏動(dòng)，頻率40～130bpm；無血清培養(yǎng)時(shí)，心肌細(xì)胞體積減小，搏動(dòng)減弱。心肌細(xì)胞純度為90％。 3.心肌細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，聯(lián)合感染rAAV-9HRE.hVEGF165、rAAV-rtTA-Rs-M2與rAAV-TRE-Tight-Ang-1(缺氧+DOX)組可同時(shí)觀察到綠色和紅色熒光。 4.RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，A、B、C組均見hVEGF165mRNA和蛋白表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)

7、度依次減弱。C、D、E組均見Ang-1mRNA和蛋白表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度依次增強(qiáng)。其中，C組hVEGF165、Ang-1mRNA和蛋白同期表達(dá)，對(duì)照組雙目的基因均無表達(dá)。 結(jié)論： 1.rAAV-9HRE-hVEGF165包裝和純化后，得到的病毒純度及滴度均較高，能滿足細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)的要求。 2.在細(xì)胞水平，以rAAV2為載體的9HRE/Tet-on-Advanced基因雙調(diào)控系統(tǒng)，通過氧環(huán)境及Dox濃度改變，可有效地調(diào)控