Tet-off系統(tǒng)調(diào)控人IFN-γ基因在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、IFN-α在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中療效顯著，可使50﹪-70﹪的CML患者獲得血液學(xué)完全緩解、10﹪-26﹪獲得主要細(xì)胞遺傳學(xué)緩解。IFN-γ在多種實體瘤及某些血液腫瘤的臨床試驗中治療效果令人失望；但對慢性粒細(xì)胞白血病有肯定的療效。體外IFN-γ能顯著地抑制CML骨髓來源的Ph+原始干(祖)細(xì)胞增殖，為Ph-造血祖細(xì)胞騰出生長的空間<'[8]>；臨床試驗中，IFN-γ也能使部分CML患者獲得完全血液學(xué)緩解及細(xì)胞遺傳學(xué)改善<'[9]

2、>。 臨床上，IFN治療CML需長期維持治療，治療非常不方便；我們實驗室既往開展了重組腺病毒IFN-γ基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗慢性粒細(xì)胞白血病的研究，體外實驗及動物實驗均獲得了良好效果。證實了IFN-γ基因可借助于骨髓基質(zhì)細(xì)胞載體的歸巢特性和靶向作用，在造血組織和腫瘤組織中持續(xù)表達(dá)，發(fā)揮抗慢性粒細(xì)胞白血病作用。 過量的IFN-γ在抗CML同時能明顯抑制和損傷正常造血干細(xì)胞，而且基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在骨髓中原位產(chǎn)生的IF

3、N-γ比外源注射IFN-γ所致骨髓毒性更明顯。1996年Selleri等<'[29]>使用逆轉(zhuǎn)錄病毒把IFN-γ基因轉(zhuǎn)染到骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源產(chǎn)生20 u/ml IFN-γ就有相似于隔天200 u/ml或每周1000 u/ml外源IFN-γ的抑制長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(long-term culture-initiming cells，LTC-IC)生長和抑制集落(CFU-GM或BFU-E)形成的作用。因而我們既往開展的這種抗白血病基因治

4、療可能導(dǎo)致大量IFN-γ在骨髓原位產(chǎn)生，而導(dǎo)致嚴(yán)重的骨髓抑制，需建立調(diào)控式表達(dá)才能試用于臨床。 Tet-off系統(tǒng)具有高效、特異、低毒和能嚴(yán)密開關(guān)目的基因的特點，在體內(nèi)也具有良好的調(diào)控基因表達(dá)效果，該系統(tǒng)并不存在于天然的真核細(xì)胞中，可能適合于用來調(diào)控人IFN-γ基因在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。 在本研究中，我們構(gòu)建質(zhì)粒pTre-IFN-γ，使用脂質(zhì)體將質(zhì)粒pTet-off和pTre-IFN-γ共轉(zhuǎn)染小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，RT-PCR及E

5、LISA法檢測IFN-γ的表達(dá)，初步探討Tet-off系統(tǒng)介導(dǎo)的人IFN-γ基因在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中可調(diào)控式表達(dá)；達(dá)到防治基因治療中IFN-γ的骨髓毒性的目的。 2．實驗方法 2．1 pTre-IFN-γ的構(gòu)建和鑒定PCR法擴增獲得帶酶切位點的人IFN-γ基因，SacⅡ和Xba Ⅰ酶切質(zhì)粒pTre和目的基因，T4連接酶連接酶切產(chǎn)物獲得重組體pTre-IFNI-γ。雙酶切和測序鑒定重組體。 2．2 小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞

6、的分離和培養(yǎng)無菌條件下取BALB/C小鼠脛骨，使用1ml注射器以DMEM-LG培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，常溫下以900RPM/分，離心分離，以DMEM-LG完全培養(yǎng)基(含15﹪胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，100 units/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素)重懸細(xì)胞，按1×10<'6>細(xì)胞/cm<'2>密度接種于25 cm<'2>組織培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5﹪CO<,2>細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，培養(yǎng)3～4天

7、后，全量換液去除懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每3天半量換液1次。約12-18天左右培養(yǎng)至達(dá)80﹪融合時，以0.25﹪胰酶(含0.1﹪EDTA)在37℃消化3～5分鐘，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變?yōu)槎趟笮巍㈩悎A形，大多從壁上脫落時中止消化。重懸細(xì)胞，接種濃度為2×10<'5>/ml，將獲得的2～3代骨髓基質(zhì)細(xì)胞用于下一步實驗。 2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)pTet-off與pTre-IFN-γ共轉(zhuǎn)染鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞及檢測IFN-γ表達(dá)規(guī)律取2

8、×10<'6>個對數(shù)生長期小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種于75cm<'2>的培養(yǎng)瓶中，24 h貼壁后用PBS液洗滌兩遍，加5 ml無血清LG-DMEM培養(yǎng)液；用250 μ l無菌生理鹽水稀釋24 μ l HifectinⅡ真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，pTet-off和pTre-IFN-γ各6 μg溶于250 μl無菌生理鹽水中，混合HifectinⅡ和質(zhì)粒，室溫放置15 min，加入上述準(zhǔn)備好的細(xì)胞中搖勻；4 h后吸去轉(zhuǎn)染物，PBS液洗滌細(xì)胞兩遍，加入3

9、ml全培養(yǎng)液。每天定時更換和收集培養(yǎng)液，實驗重復(fù)3次。ELISA法檢測每天收集的BMSCs培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌量。另外實驗組共轉(zhuǎn)染后48小時提取細(xì)胞總RNA，行RT-PCR檢測IFN-γmRNA在BMSCs中的表達(dá)。 2.4 不同濃度鹽酸四環(huán)素對IFN-γ蛋白分泌的影響取5×10<'5>個對數(shù)生長期細(xì)胞每孔接種于6孔板中，24 h貼壁后按pTet-off、pTre-IFN-γ各2 μ g和Hifectin Ⅱ8 μ l每孔

10、共轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，4 h后吸去轉(zhuǎn)染物，PBS液沖洗2遍，加入1 ml分別含0、1、5、10、100、1000 ng/ml鹽酸四環(huán)素的全培養(yǎng)液，每種濃度重復(fù)3孔，48 h后收集培養(yǎng)液，儲存于-20℃?zhèn)溆茫鳛镋LISA法檢測IFN-γ分泌量的標(biāo)本。 2.5 鹽酸四環(huán)素在不同時間階段對IFN-γ蛋白分泌的影響取5×10<'5>個對數(shù)生長期細(xì)胞每孔接種于6孔板中，24h貼壁后按pTet-off、pTre-IFN-γ各2 μg和Hif

11、ectin Ⅱ8 μl每孔共轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，4h后吸去轉(zhuǎn)染物，PBS液沖洗2遍，加入1 ml無四環(huán)素的全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h待有一定基礎(chǔ)量IFN-γ蛋白表達(dá)后，開始分別使用含0、5、100ng/ml鹽酸四環(huán)素的全培養(yǎng)液，每種濃度同時做4孔，然后每隔8h換液和收集培養(yǎng)上清；鹽酸四環(huán)素添加前48h的培養(yǎng)上清、添加四環(huán)素后緊接著的3個8 h的培養(yǎng)上清為ELISA法檢測IFN-γ分泌量的標(biāo)本。統(tǒng)計采用SPSS10.0軟件包，單處理因素三組方差分

12、析。 3.結(jié)果 3.1 酶切電泳鑒定及測序結(jié)果重組體雙酶切后見3.1 kb的載體和527 bp的目的基因條帶，測序顯示重組體中人IFN-γ基因序列完全正確，并已定向插入載體質(zhì)粒pTre，證實重組成功。 3.2 RT-PCR結(jié)果共轉(zhuǎn)染組電泳見約527 bp的IFN-γ基因條帶及245 bp的β-actin基因條帶，非轉(zhuǎn)染組電泳僅見245 bp的β-actin基因條帶；證實了共轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IFN-γmRN

13、A，未轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞無表達(dá)。 3.3 IFN-γ蛋白的分泌規(guī)律每1×10<'6>個骨髓基質(zhì)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染后前7天的IFN-γ蛋白24 h分泌量(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為85.23±52.04 pg、621.95±1 81.39 pg、720.09±241.51 pg、115.79±59.10pg、59.96±31.98 pg、19.93±12.54 pg、1.21±3.32 pg。第3天為分泌高峰，第7天可判斷為無IFN-γ蛋白分泌

14、，7天以后和未轉(zhuǎn)染組未檢測到IFN-γ蛋白分泌。 3.4 不同濃度鹽酸四環(huán)素對IFN-γ蛋白表達(dá)的調(diào)控效應(yīng)按0、1、5、10、100、1000 ng/ml濃度添加鹽酸四環(huán)素，5×10<'5>個骨髓基質(zhì)細(xì)胞前48 h中IFN-γ蛋白分泌量(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)相應(yīng)分別為：274.93±32.20 pg，186.49±68.69 pg，81.35±22.42 pg，25.60±9.89 pg，6.06±3.49 pg，1.72±2.60

15、pg?？梢?8 h蛋白分泌量隨四環(huán)素增加逐漸減少至接近零。 3.5 鹽酸四環(huán)素不同作用時間對IFN-γ表達(dá)的影響5×10<'5>個骨髓基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后添加鹽酸四環(huán)素前的48 h所有孔中均有一定量的IFN-γ基礎(chǔ)表達(dá)。在含0 ng/ml鹽酸四環(huán)素的孔中隨后3個8 h均有一定量表達(dá)；在含5ng/ml鹽酸四環(huán)素的孔中隨后的第1、2個8 h仍有表達(dá)，但量較含0 ng/ml四環(huán)素組低，第3個8 h表達(dá)量更低；在100 ng/ml鹽酸四環(huán)素的

16、孔中接著的第1個8 h表達(dá)量與含0 ng/ml四環(huán)素組相比明顯降低，后2個8 h基本沒有表達(dá)。方差分析示0、5、100ng/ml三組比較，無四環(huán)素時前48h p>0.05；添加四環(huán)素第1、2個8h三組間p<0.05；但第三個8h三組間p=0.055無統(tǒng)計學(xué)意義。 4.結(jié)論 4.1 Sac Ⅱ、Xba Ⅰ雙酶切和測序結(jié)果證實質(zhì)粒pTre-IFN-γ構(gòu)建成功，人IFN-γ基因成功地插入到質(zhì)粒pTre中的TRE元件下游。

17、 4.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)pTet-off和pTre-IFN-γ共轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞后RT-PCR可檢測到IFN-γmRNA表達(dá)，ELISA法檢測到第三天的IFN-γ分泌高峰為約720pg每10<'6>個細(xì)胞，分泌持續(xù)6天，分泌量較少，但能滿足進行四環(huán)素的調(diào)控實驗。 4.3 隨添加的鹽酸四環(huán)素濃度增加，共轉(zhuǎn)染后IFN-γ前48 h分泌量下降，10-100ng/ml的鹽酸四環(huán)素可接近完全地關(guān)閉IFN-γ的表達(dá)，抑制效應(yīng)是高效和嚴(yán)密的；第