TPO基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓基質(zhì)細胞促進造血功能重建的研究.pdf

1、目的：造血干細胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT)是治療惡性血液病、放化療敏感的實體腫瘤以及急性放射病的重要手段。HSCT后造血重建緩慢，出現(xiàn)骨髓造血抑制期，白細胞、血小板少，感染和出血成為移植后的主要并發(fā)癥之一，也是移植相關(guān)死亡的主要原因。目前認為HSCT后造血重建緩慢與基質(zhì)損傷、缺乏合適的促進造血干/祖細胞增殖、分化的微環(huán)境有關(guān)。自G-CSF、GM-CSF應用于臨床以來，明顯地

2、縮短了中性粒細胞缺乏時間，降低了感染的發(fā)生率。然而目前針對因血小板減少引起的急性出血，臨床上主要依賴輸注血小板懸液，但長期輸注血小板有可能帶來許多嚴重副作用，存在價格昂貴、反復輸注產(chǎn)生血小板抗體導致無效性血小板輸注等諸多問題。已證實，TPO是調(diào)控血小板生成的首要、特異性因子。因此，本課題以微環(huán)境的主要成分——骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)為靶細胞，用脂質(zhì)體將含小鼠TPOcDNA編碼區(qū)的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，通過觀察轉(zhuǎn)染TPO基因的BM

3、SCs移植對放射損傷后小鼠在血小板恢復及造血重建方面的作用，探索基質(zhì)細胞介導的造血生長因子基因治療促進造血功能重建的可行性。 方法：體外部分：參照Dexter法分離培養(yǎng)小鼠BMSCs，免疫細胞化學法及細胞化學染色法鑒定小鼠BMSCs，脂質(zhì)體介導含小鼠TPOcDNA編碼區(qū)的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，RT-PCR、免疫細胞化學法及Westernblot法檢測目的基因轉(zhuǎn)染BMSCs后TPO在mRNA和蛋白水平的表達，以轉(zhuǎn)染空載體(p

4、cDNA3.1)質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的BMSCs作為對照。體內(nèi)部分：采用單次劑量6.5Gy的60Co-γ射線照射受體鼠，照射后動物隨機分四組，單純骨髓細胞移植組(A組)、未轉(zhuǎn)染BMSCs+骨髓細胞移植組(B組)、轉(zhuǎn)染TPO基因的BMSCs+骨髓細胞移植組(C組)、轉(zhuǎn)染空載體的BMSCs+骨髓細胞移植組(D組)，分別于照射后24小時內(nèi)給予骨髓細胞、BMSCs移植，在不同時相點進行血細胞計數(shù)，取股骨骨髓細胞行瑞氏染色，肝、脾組織行HE染色，進行組織

5、病理學檢測。 結(jié)果：實驗主要結(jié)果如下： 1.小鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定BMSCs形態(tài)呈異質(zhì)性，原代細胞呈集落生長，傳代后則均勻生長，免疫細胞化學法顯示小鼠抗小鼠波形蛋白陽性，大鼠抗小鼠DC單抗陰性，證實為小鼠BMSCs。 2.轉(zhuǎn)染后BMSCs其TPO在mRNA和蛋白水平的表達RT-PCR結(jié)果：TPO基因轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組細胞TPO與GAPDH光密度比值分別為0.622±0.011、0.182±0.01

6、4和0.172±0.007，免疫細胞化學法顯示：TPO基因轉(zhuǎn)染組細胞胞漿呈陽性表達，余2組陰性，Westernblot結(jié)果：TPO基因轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組細胞TPO與GAPDH光密度比值分別為0.74±0.06、0.28±0.04和0.30±0.04，TPO基因轉(zhuǎn)染組細胞mRNA和蛋白水平明顯高于對照組(P均＜0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功。 3.TPO基因轉(zhuǎn)染小鼠BMSCs對放射損傷小鼠造血功能重建的影響 3.1血

7、細胞計數(shù)：B組、C組、D組WBC最低值較A組高(P均＜0.05)，且WBC的恢復時間提前約7天，同時有一定程度加速Plt的恢復(P均＞0.05)。A組、B組、D組Hb持續(xù)緩慢下降，至第28天達最低值，而C組于照射后14天降至最低點，然后逐漸回升，第28d時Hb水平較A組、B組、D組高(P均＜0.05)。C組Plt下降程度輕，最低值較A組、B組、D組高(P均＜0.05)，且維持在較高水平，同時有顯著促進Hb恢復的作用(P均＜0.05)。

8、 3.2細胞組織學檢測：C組較A組、B組、D組骨髓和脾臟均可見明顯的巨核細胞數(shù)量增多，各組骨髓組織內(nèi)均未見纖維化，肝臟內(nèi)未見任何造血組織(包括巨核細胞)分布。 結(jié)論：脂質(zhì)體介導真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs方法可行，通過體外檢測TPO在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平表達的變化，發(fā)現(xiàn)TPO基因轉(zhuǎn)染組TPO的表達明顯增多，體內(nèi)動物實驗進一步揭示，骨髓細胞聯(lián)合BMSCs移植有利于造血快速重建，主要是加速WBC的恢復，而TPO基因療法主要促進Plt的