人臍血源基質(zhì)細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞對造血功能損傷修復(fù)作用的比較.pdf

1、研究背景:
　　造血微環(huán)境作為造血干細(xì)胞重要的生存環(huán)境,對造血干細(xì)胞的生長、成熟和分化發(fā)揮著重要作用。腫瘤患者化/放療后的造血功能損傷嚴(yán)重影響患者的治療進(jìn)程,究其原因除造血干細(xì)胞受損外,造血微環(huán)境損傷比造血實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷導(dǎo)致的造血功能障礙可能更加持久甚至不可逆轉(zhuǎn),這已成為臨床上束縛腫瘤患者接受后續(xù)治療的主要限制性因素。研究發(fā)現(xiàn):輸注人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(humanbonemarrowstromalcells,hBMSCs)能夠促進(jìn)造血損傷

2、的恢復(fù)和減輕移植后GVHD發(fā)生,提高移植成功率。但hBMSCs存在著來源受限,采集供者骨髓過程比較繁瑣和痛苦且存在風(fēng)險,細(xì)胞數(shù)量及增殖分化能力受供者年齡影響等缺點(diǎn)。此外,許多患者自身就存在著骨髓基質(zhì)細(xì)胞功能的異常,這大大降低了自體輸注骨髓基質(zhì)細(xì)胞的可行性;如果采用異體移植亦有可能面對組織相容性問題,因此限制了hBMSCs在臨床上的廣泛使用。
　　人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(humanumbilicalcordbloodderivedstro

3、malcells,hUCBDSCs)是我室培養(yǎng)建立的新型基質(zhì)細(xì)胞,前期研究證實(shí)其在體外能有效支持造血干/祖細(xì)胞增殖,特別是在促進(jìn)巨核系集落形成方面具有優(yōu)勢作用。而hUCBDSCs與骨髓基質(zhì)細(xì)胞相比較,其對造血損傷的修復(fù)作用有何差別是需要探討的課題。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)比較兩種不同來源的基質(zhì)細(xì)胞在修復(fù)小鼠造血功能損傷方面的作用,旨在進(jìn)一步驗(yàn)證hUCBDSCs的臨床應(yīng)用價值。
　　一、本研究的主要內(nèi)容和研究方法如下
　　1.培養(yǎng)人

4、臍血源基質(zhì)細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞,并采用細(xì)胞化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)對兩種細(xì)胞組成進(jìn)行鑒定,探討改良臍血基質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的條件和方法。
　　2.給予BALB/c小鼠6.0Gy6oCo射線全身照射,觀察小鼠生存期及1d、3d、5d、7d、14d、21d血象變化,構(gòu)建造血微環(huán)境功能損傷動物模型。
　　3.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞及人骨髓基質(zhì)細(xì)胞輸注造血微環(huán)境損傷動物模型,檢測觀察血常規(guī)、骨髓象、集落形成單位等造血修復(fù)相關(guān)指標(biāo),比較兩種不同來源基質(zhì)

5、細(xì)胞對造血損傷的修復(fù)作用。
　　二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.人臍血基質(zhì)細(xì)胞和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:
　　1)人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具有以下形態(tài)學(xué)特點(diǎn):①成分不均一,可見“成纖維樣”細(xì)胞;“巨噬樣”細(xì)胞,“小圓樣”細(xì)胞。②細(xì)胞化學(xué)提示糖原強(qiáng)陽性,陽性率100％;免疫細(xì)胞化學(xué)顯示:CD106呈陽性;CD44陽性;Fn陽性;CD50呈陽性,CD45陰性。2)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn):①成分較均一,剛接種時可呈集落生長,約3天后細(xì)胞

6、開始呈梭形,10天后集落消失,大部分細(xì)胞呈梭形,且生長周期較人臍血源基質(zhì)細(xì)胞短。
　　2.人臍血基質(zhì)細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng):兩種細(xì)胞均在70%-80%融合時開始進(jìn)行傳代,培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件不變,人臍血基質(zhì)細(xì)胞采取1:1的比例,骨髓基質(zhì)細(xì)胞采取1:3傳入相同容積的培養(yǎng)瓶中。人臍血基質(zhì)細(xì)胞隨著傳代次數(shù)越多,細(xì)胞形態(tài)趨于一致,以“成纖維樣”細(xì)胞,形態(tài)上主要以梭形細(xì)胞為主,其余兩種細(xì)胞數(shù)量明顯減少。骨髓基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞在原代時就以梭形細(xì)胞

7、為主,隨著傳代的次數(shù)增多,細(xì)胞形態(tài)變化不大。
　　3.造血功能損傷動物模型的建立:將10只BALB/c小鼠以6.0Gy6oCo射線全身照射,10只小鼠無死亡,血象中WBC、Plt、RBC均在5d降至最低,而HB則在7d時最低,RBC、HB在21d時恢復(fù)至照射前水平,WBC及Plt則在21d恢復(fù)水平低于照射前。造血損傷動物模型建立。
　　3.人臍血基質(zhì)細(xì)胞和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞對造血損傷修復(fù)作用的比較研究:①對照組在3d時WBC下降

8、,10d開始回升,21d時未能恢復(fù)至照射前水平,hUCBDSCs組及hBMSCs組波動情況同對照組,不同的是21d時兩組恢復(fù)接近照射前水平,但hUCBDSCs組要優(yōu)于hBMSCs組(P<0.05)。②對照組在10d時Plt降至最低,之后開始緩慢恢復(fù),21d時無法恢復(fù)至照射前水平。hUCBDSCs組7d時降至最低,之后開始恢復(fù),21d時恢復(fù);hBMSCs組3d時最低,10d后開始恢復(fù),21d恢復(fù)。hUCBDSCs組較其他兩組降低程度最輕(

9、P<0.05),且恢復(fù)速度優(yōu)于hBMSCs組和對照組(P<0.05)。③三組均在3d時RBC降至最低,10d后開始恢復(fù),實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對照組(P<0.05),兩組實(shí)驗(yàn)組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。④骨髓象中7d時hUCBDSCs組及hBMSCs組移植后均有輕度骨髓抑制,21d實(shí)驗(yàn)組均骨髓有核細(xì)胞增生活躍,紅系恢復(fù)情況不佳;與此同時對照組骨髓增生降低,有核細(xì)胞減少,③集落培養(yǎng)CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM三組均是在

10、7d時最低,21d時最高,但hUCBDSCs組移植后7d、14d、21d,所有集落均優(yōu)于其他兩組(P<0.05)且骨髓抑制程度輕,所有小鼠均存活。
　　三、研究得出以下結(jié)論:
　　1.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具備造血基質(zhì)細(xì)胞的基本生物學(xué)特點(diǎn);
　　2.在本實(shí)驗(yàn)條件下,人臍血基質(zhì)細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞均具有修復(fù)造血功能損傷的作用;
　　3.對于造血損傷的修復(fù)作用,人臍血基質(zhì)細(xì)胞促白細(xì)胞、血小板恢復(fù)作用要明顯優(yōu)于hBMSC;