Cx43修飾人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對SUP-B15細(xì)胞體外調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、造血微環(huán)境(hemopoietic microenvironment;HME)是孕育和調(diào)控造血干/祖細(xì)胞生長發(fā)育的“土壤”,骨髓基質(zhì)細(xì)胞是其主要功能成分。白血病細(xì)胞的生長同樣依賴造血微環(huán)境的調(diào)控和支撐;骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stroma cells, BMSCs)對白血病細(xì)胞所產(chǎn)生的支持和“庇護(hù)”作用是白血病殘留、耐藥進(jìn)而難治的重要因素。已有多項研究表明,白血病微小殘留病(Minimal residual Disease

2、/leukemia,MRD/MRL)是導(dǎo)致白血病臨床難以治愈、易復(fù)發(fā)的重要原因,而異常的造血微環(huán)境為殘留白血病細(xì)胞的生存提供了條件,因此,探索造血微環(huán)境對急性白血病的調(diào)節(jié)作用,從新的角度尋求清除白血病的新方法和新靶點具有重要意義。
　　造血微環(huán)境主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子構(gòu)成,骨髓基質(zhì)細(xì)胞是其主要成分。目前,有關(guān)造血微環(huán)境對白血病細(xì)胞的調(diào)控作用,國內(nèi)外的研究多側(cè)重在白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附、分泌等功能變化對白血病細(xì)胞的

3、影響方面,而對白血病骨髓基質(zhì)間隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)功能方面研究甚少。
　　研究表明:正常造血的調(diào)控依賴于骨髓基質(zhì)細(xì)胞間信號分子的傳遞,其中,間隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication, GJIC)被認(rèn)為是骨髓基質(zhì)參與造血調(diào)控的必要條件。在人類造血組織中參與骨髓基質(zhì)細(xì)胞 GJIC功能調(diào)控

4、的主要為連接蛋白43(connexin43, Cx43)。我們既往的研究發(fā)現(xiàn):急性白血病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞GJIC功能降低,上調(diào)骨髓基質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)可增強(qiáng)GJIC功能,在體外共培養(yǎng)體系中能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖。我們前期的研究工作還發(fā)現(xiàn):人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(human Umbilical Cord Blood-derived Stem Cells, hUCBDSCs)具有優(yōu)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的造血損傷修復(fù)作用,

5、同時在體外試驗中發(fā)現(xiàn)其具有抑制白血病細(xì)胞增殖的作用,具有良好的臨床應(yīng)用前景。那么,在我們前期工作的基礎(chǔ)上將 GJIC功能和人臍血源基質(zhì)細(xì)胞結(jié)合起來是否對白血病細(xì)胞具有更強(qiáng)的調(diào)節(jié)抑制作用呢?這是我們本課題設(shè)想的起因。
　　Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病(Ph+ Acute Lymphocytical Leukemia,Ph+ALL)臨床療效差,即使治療后完全緩解,仍有較高的短期內(nèi)復(fù)發(fā)率。那么,能否從造血微環(huán)境角度探索治療此類白血病的新方法

6、呢?鑒于此,本課題在前期研究基礎(chǔ)上,分離培養(yǎng)hUCBDSCs,用Cx43基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染hUCBDSCs形成飼養(yǎng)層與Ph+ALL細(xì)胞株 SUP-B15共培養(yǎng),通過上調(diào)其 Cx43的表達(dá)增強(qiáng) GJIC功能,在體外條件下觀察hUCBDSCs對SUP-B15細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　1.研究內(nèi)容及方法:
　　建立hUCBDCSCs與SUP-B15細(xì)胞株體外共培養(yǎng)模型
　　沿用本科室改良的方法從健康產(chǎn)婦臍帶血中分離培養(yǎng)hUCB

7、DSCs。SUP-B15培養(yǎng)方法參照細(xì)胞株購買說明。倒置顯微鏡及掃描電鏡對細(xì)胞接觸共培養(yǎng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。摸索適宜的共培養(yǎng)條件。
　　Cx43重組腺病毒(Ad-Cx43-GFP)轉(zhuǎn)染hUCBDSCs
　　用PCR法檢測目的基因RNA的表達(dá),用免疫熒光法檢測Cx43蛋白的表達(dá)。熒光漂白再恢復(fù)技術(shù)(Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP)檢測hUCBDSCs轉(zhuǎn)染前后GJIC

8、功能。
　　觀察Cx43基因轉(zhuǎn)染前后hUCBDSCs對SUP-B15細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
　　實驗分4組:
　　1) SUP-B15組:單獨培養(yǎng)的SUP-B15組;
　　2) hUCBDSCs/SUP-B15組:人臍血源基質(zhì)細(xì)胞與SUP-B15共培養(yǎng)組;
　　3) Ad-hUCBDSCs/SUP-B15組:Ad-GFP轉(zhuǎn)染的hUCBDSCs與SUP-B15細(xì)胞共培養(yǎng)組;
　　4) Ad-Cx43-hUCBD

9、SCs/ SUP-B15組:Ad-Cx43-GFP轉(zhuǎn)染的 hUCBDSCs與SUP-B15細(xì)胞共培養(yǎng)組。
　　CCK-8法檢測共培養(yǎng)后的SUP-B15細(xì)胞生長曲線,對比各組間SUP-B15細(xì)胞增殖率。流式細(xì)胞技術(shù)檢測共培養(yǎng)后SUP-B15細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期,從而探討Cx43基因表達(dá)水平上調(diào)、GJIC功能增強(qiáng)的hUCBDSCs在體外共培養(yǎng)條件下對SUP-B15細(xì)胞的增殖產(chǎn)生的影響。
　　2.實驗結(jié)果:
　　2.1以含2

10、0％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基為培養(yǎng)液可實現(xiàn)兩種細(xì)胞的體外接觸共培養(yǎng),掃描電鏡見兩者間相互粘附,有偽足形成。共培養(yǎng)第3天,光鏡下可見懸浮細(xì)胞明顯的成團(tuán)聚集趨勢,折光度較單獨培養(yǎng)組稍差;
　　2.2采用重組腺病毒 Ad-Cx43-GFP、Ad-GFP成功轉(zhuǎn)染 hUCBDSCs:轉(zhuǎn)染后24h可以觀察到綠色熒光表達(dá),48h熒光表達(dá)達(dá)峰值,轉(zhuǎn)染效率約為(89.20±3.12)%和(88.62±3.25)%;半定量 RT-PCR法、Weste

11、rn blot法及免疫熒光法結(jié)果均顯示:Ad-Cx43-GFP轉(zhuǎn)染后hUCBDSCs的Cx43mRNA表達(dá)相對量、Cx43蛋白表達(dá)量均高于空載病毒轉(zhuǎn)染組,Quantity One軟件收集整理Western blot結(jié)果,經(jīng)SPSS13.0分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);GJIC功能結(jié)果顯示:Ad-Cx43-GFP組熒光淬滅后40s時可恢復(fù)至接近淬滅前,而對照組熒光無法恢復(fù)。
　　2.3 Cx43基因修飾的hUCBDSCs對

12、SUP-B15細(xì)胞增殖、凋亡的影響
　　2.3.1 CCK-8細(xì)胞增殖檢測:Cx43表達(dá)水平的上調(diào)抑制SUP-B15細(xì)胞增殖,共培養(yǎng)72h后轉(zhuǎn)染Cx43組SUP-B15細(xì)胞的增殖明顯受抑制,相對增殖率為28%,明顯低于 SUP-B15單獨培養(yǎng)組(53.6%)及空載病毒轉(zhuǎn)染組(71.9%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　2.3.2流式細(xì)胞凋亡檢測:轉(zhuǎn)染Cx43的人臍血源基質(zhì)細(xì)胞組SUP-B15細(xì)胞凋亡率(5.51±0

13、.51%)明顯高于未轉(zhuǎn)染組(2.26±1.41%)和陰性對照組(2.97±1.58%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.3.3流式細(xì)胞周期檢測: Cx43腺病毒轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞比例約為66.43%,較單獨培養(yǎng)組(81.54%)明顯降低,但與未轉(zhuǎn)染組的結(jié)果64.02%相近;Cx43轉(zhuǎn)染組 S期細(xì)胞比例為19.42%,與未轉(zhuǎn)染組的19.36%相近。細(xì)胞周期檢測數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。