VCAM-1基因修飾人臍血源基質(zhì)細(xì)胞移植重建造血微環(huán)境功能.pdf

1、骨髓造血微環(huán)境(hematopoieticinductivemicroenvironment，HIM)是造血干/祖細(xì)胞生長發(fā)育的“土壤”，基質(zhì)細(xì)胞作為造血微環(huán)境中的重要成分，不僅與造血干/祖細(xì)胞的歸巢定位、增殖分化和自我更新密切相關(guān)，而且在某些血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中具有非常重要的作用，探討基質(zhì)細(xì)胞在造血調(diào)控中的作用需繼續(xù)深入。人臍血中的細(xì)胞成分豐富且較骨髓和外周血更原始；臍血細(xì)胞具有來源廣泛、采集方便、GVHD輕和高增殖的

2、特點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景廣闊。目前對造血基質(zhì)細(xì)胞的研究主要側(cè)重于骨髓基質(zhì)細(xì)胞，而對于臍血中是否存在基質(zhì)細(xì)胞，臍血源基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)如何，能否作為一種新型的造血基質(zhì)細(xì)胞來源等問題尚缺乏系統(tǒng)深入的研究；血管細(xì)胞粘附分子(vascularcelladhsionmolecule-1，VCAM-1)是骨髓基質(zhì)細(xì)胞參與造血調(diào)控不可缺少的粘附分子，它與受體整聯(lián)蛋白(Integrin)家族中的α4β1特異性結(jié)合能起到固定造血干細(xì)胞于骨髓基質(zhì)的作用，對造血

3、干/祖細(xì)胞的增殖、分化、遷移中發(fā)揮重要調(diào)控作用。 鑒于此，本課題將人臍血CD34+細(xì)胞，采用Dexter貼壁細(xì)胞培養(yǎng)體系行臍血源基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，探討人臍血細(xì)胞體外擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞的可行性和有效性；研究人臍血源基質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境的造血支持作用；構(gòu)建熒光蛋白標(biāo)記的VCAM-1腺病毒載體并轉(zhuǎn)染人臍血源基質(zhì)細(xì)胞，移植給造血微環(huán)境輻射損傷裸鼠，探討其對重建造血微環(huán)境功能及促進(jìn)造血損傷修復(fù)的作用，為平戰(zhàn)條件下造血功能損傷的救治提供新的輔助治療措施。

4、 1.研究內(nèi)容及方法： 1.1分離人臍血CD34+細(xì)胞，采用Dexter貼壁細(xì)胞培養(yǎng)體系行臍血源基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增，采用光鏡，電鏡、組織細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞儀等技術(shù)對臍血源基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定； 1.2采用DNA重組技術(shù)，將目的基因VCAM-1克隆至含有報(bào)告基因EGFP的穿梭質(zhì)粒；在BJ5183細(xì)胞中與腺病毒基因組進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒；在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將重組的腺病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，使腺病

5、毒在293細(xì)胞中包裝復(fù)制，并對轉(zhuǎn)染后的293細(xì)胞進(jìn)行熒光觀測，檢測培養(yǎng)上清目的蛋白的表達(dá)；用高效轉(zhuǎn)染載體將VCAM-1基因修飾人臍血源基質(zhì)細(xì)胞并檢測其表達(dá)； 13ELISA檢測臍血源基質(zhì)細(xì)胞造血生長因子GM-CSF、SCF、TPO的表達(dá)水平，RT-PCR方法檢測GM-CSF、SCF、TPO等指標(biāo)mRNA表達(dá)水平；對比觀察有、無VCAM-1基因修飾的人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對臍血干\祖細(xì)胞體外擴(kuò)增能力的異同； 1.4對裸鼠分別實(shí)施

6、Co60γ3.5Gy、5Gy、6.5Gy、8Gy輻射劑量損傷，觀察裸鼠輻經(jīng)射損傷后不同時相點(diǎn)的血象、骨髓像、骨髓病理切片、CFU-F、VCAM-1等指標(biāo)變化，探索適合本研究有關(guān)的造血微環(huán)境損傷的動物模型的適宜輻射劑量； 1.5本研究分為經(jīng)裸鼠尾靜脈輸注生理鹽水對照組、無VCAM-1修飾的人臍血源基質(zhì)細(xì)胞和VCAM-1修飾的人臍血源基質(zhì)細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)組，探討造血微環(huán)境輻射損傷裸鼠的造血功能損傷的恢復(fù)及其機(jī)制。 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

7、 2.1人臍血源基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定：人臍血源基質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上具有“成纖維樣”、“巨噬樣”、“小圓樣”細(xì)胞等三種主要形態(tài)。細(xì)胞化學(xué)染色提示：①非特異性酯酶染色法(NSE)：陽性，陽性率100％；②過氧化物酶染色法(POX)：陰性；③糖原染色(PAS)：陽性，陽性率100％；④堿性磷酸酶(ALP)染色：部分陽性，陽性率28％。免疫細(xì)胞化學(xué)染色提示：①CD106(VCAM-1)：陽性率16％；②CD29(整合素-β1)：陽性率93％

8、；③CD44：陽性率98％；④CD45：陰性；⑤CD50：陽性率62％；⑥纖維粘連蛋白(Fn)：陽性率92％；⑦層粘連蛋白(Lm)：陽性率74％；⑧膠原Ⅳ：陽性率83％。經(jīng)對臍血源基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)貼壁率、CFU-F計(jì)數(shù)、透射電鏡、細(xì)胞周期、生長曲線等檢測的結(jié)果提示，人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具備造血基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)； 2.2將VCAM-1克隆至含有報(bào)告基因EGFP的穿梭質(zhì)粒；在BJ5183細(xì)胞中與腺病毒基因組進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生Ad-

9、VCAM-1-EGFP重組腺病毒質(zhì)粒；經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)，重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，轉(zhuǎn)染后的293細(xì)胞內(nèi)可見熒光顯示，WestemBlot檢測培養(yǎng)上清有目的蛋白表達(dá)；將VCAM-1基因?qū)肴四氀椿|(zhì)細(xì)胞，熒光顯微鏡可觀察到轉(zhuǎn)染后的臍血源基質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)顯示綠色熒光，并半定量RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實(shí)目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)； 2.3RT-PCR和ELISA法檢測：體外原代培養(yǎng)的人臍血源基質(zhì)細(xì)胞能表達(dá)和分泌GM-CSF

10、、SCF和TPO。與骨髓基質(zhì)細(xì)胞比較：GM-CSF和SCF的表達(dá)較骨髓基質(zhì)細(xì)胞低(P＜0.01)，而TPO的表達(dá)水平較骨髓基質(zhì)細(xì)胞高(P＜0.05)；HUCBSC為滋養(yǎng)層的擴(kuò)增體系能夠?qū)δ氀狢D34+細(xì)胞進(jìn)行有效擴(kuò)增，擴(kuò)增后的臍血CD34+細(xì)胞形成的CFU-GM、CFU-E和CFU-MEG顯著高于對照組(P＜0.01)，其中以VCAM-1-HUCBSC組對CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增作用最佳(P＜0.01)； 2.48.0Gy輻射劑量裸

11、鼠死亡率100％；3.5Gy、5Gy、6.5Gy輻射劑量組裸鼠的造血損傷均能在輻射后21之內(nèi)自我恢復(fù)，絕大部分裸鼠能存活；6.5Gy組骨髓CFU-F于移植后+7(22±6)、+14天(33±6)較3.5Gy、5Gy組均具有顯著性差異(P＜0.01)，VCAM-1表達(dá)于+7(21.67±7.45)、+14天(22.33±9.07)、+21天(23.33±4.51)較對照組具有顯著性差異(P＜0.01)、較3.5Gy組有顯著性差異(P＜0.

12、05)，+21天(23.33±4.51)較5Gy組(34.00±4.36)顯著性差異(P＜0.05)； 2.5HUCBSC輸注具有修復(fù)輻射損傷造血微環(huán)境的作用并具有促進(jìn)輻射造血功能損傷恢復(fù)的作用(P＜0.05)，在血象、骨髓像恢復(fù)時間、骨髓病理切片、CFU-F、CFU-GM、BFU-E、CFU-Meg、VCAM-1等檢測結(jié)果與生理鹽水對照組具有顯著性差異(P＜0.05)；VCAM-1修飾的人臍血源基質(zhì)細(xì)胞移植組的療效顯著(P＜0

13、.01)。 3.結(jié)論： 3.1人臍血中存在造血微環(huán)境基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，體外培養(yǎng)的人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具有造血基質(zhì)細(xì)胞的基本特點(diǎn)； 3.2成功構(gòu)建VCAM-1基因高表達(dá)體系，Ad-VCAM-1-EGFP重組腺病毒載體可成功轉(zhuǎn)染人臍血源基質(zhì)細(xì)胞，并使其VCAM-1表達(dá)增高； 3.3人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具有自分泌GM-CSF,SCF,TPO等造血生長因子能力，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)人臍血源基質(zhì)細(xì)胞具有促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的能