人IFn-α基因修飾NK細(xì)胞系的建立以及人IFn-α-人Il-15基因修飾NK細(xì)胞抗腫瘤功能機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　 惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，其死亡人數(shù)約占世界總死亡人數(shù)的四分之一，且死亡率常年居高不下。目前用于惡性腫瘤治療的手段主要包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和射頻消融治療等，由于缺乏特異性和靶向性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，機(jī)體正常細(xì)胞的功能也遭到破壞，從而導(dǎo)致患者免疫功能受損，生存質(zhì)量下降。近來(lái)，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的交融和發(fā)展，以機(jī)體免疫細(xì)胞為主體的細(xì)胞免疫治療，以其強(qiáng)大的抗腫瘤作用和較低的毒副作用，逐

2、步成為腫瘤治療研究的新方向。
　　 自然殺傷(Naturalkiller,NK)細(xì)胞作為機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中不可或缺的組成部分，是機(jī)體抵抗腫瘤和病毒感染細(xì)胞的第一道天然防線，也是連接天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁?；贜K細(xì)胞的抗腫瘤免疫治療以其獨(dú)特的抗腫瘤效果引起人們的高度重視，現(xiàn)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，主要包括自體NK細(xì)胞的活化，同種異體NK細(xì)胞的輸注，體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的輸注以及NK細(xì)胞系的過(guò)繼轉(zhuǎn)輸?shù)?。由于體外NK細(xì)胞的純化和大規(guī)

3、模培養(yǎng)仍具有較高的技術(shù)難度，NK細(xì)胞系以其易于體外擴(kuò)增和大規(guī)模培養(yǎng)、具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用等優(yōu)點(diǎn)，克服了自體以及同種異體NK細(xì)胞治療的局限性，具有廣闊的應(yīng)用前景。NK細(xì)胞系在體外生長(zhǎng)狀態(tài)良好，能夠通過(guò)基因修飾等手段增強(qiáng)抗腫瘤活性。
　　 在眾多活化NK細(xì)胞的細(xì)胞因子中，IFN-α占有非常重要的地位。IFN-α屬于(Ⅰ)型干擾素家族，廣泛應(yīng)用于造血系統(tǒng)腫瘤和某些實(shí)體腫瘤的治療中，并且能夠通過(guò)下調(diào)癌基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤抑制基因進(jìn)而影響

4、腫瘤細(xì)胞的功能，還能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞，比如T細(xì)胞，DC，NK細(xì)胞的分化和活化，介導(dǎo)IFN誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫活性。IFN-α現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于DC的基因修飾，使其適應(yīng)腫瘤過(guò)繼免疫治療的要求。
　　 白細(xì)胞介素-15(IL-15)是由Grabstein等于1994年在猴腎表皮細(xì)胞系cv21/EBVA的培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)，早期被定義為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在自體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫方面發(fā)揮多重作用。IL-15與IL-2在功能上有許多

5、相似之處，均可以誘導(dǎo)CD34+的細(xì)胞分化為NK細(xì)胞，但I(xiàn)L-15在NK細(xì)胞的分化和功能上發(fā)揮了更為重要的作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在IL-15Rα-/-和IL-15-/-小鼠中，NK細(xì)胞無(wú)法正常發(fā)育、成熟并發(fā)揮功能。
　　 本研究選用了兩種對(duì)NK細(xì)胞發(fā)育、分化、功能等起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子IL-15和IFN-α，對(duì)NK細(xì)胞系NKL進(jìn)行基因修飾。建立了hIFN-α基因修飾的NKL細(xì)胞，證實(shí)修飾后的細(xì)胞能夠有效抑制肝癌的生長(zhǎng)，并探討了作用機(jī)制。

6、前期實(shí)驗(yàn)中建立了hIL-15基因修飾的NKL細(xì)胞系，并證實(shí)了其在體外對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效果，本研究進(jìn)一步確證了hIL-15修飾后NKL細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)肝癌的治療效果，并初步探討了其作用機(jī)制。同時(shí)研究了hIL-15基因修飾后的NKL細(xì)胞對(duì)白血病的抑制效果和作用機(jī)制。結(jié)果證實(shí)，修飾后的NKL細(xì)胞具有更為顯著地抗腫瘤作用，更加符合腫瘤過(guò)繼免疫治療的要求。
　　 研究方法：
　　 首先，我們建立了hIFN-α基因修飾的NKL細(xì)胞，并研

7、究其對(duì)肝癌的抑制作用和殺傷機(jī)制。通過(guò)PT-PCR方法從外周血PBMC中擴(kuò)增hIFN-α1基因全長(zhǎng)，插入pSecTagB真核表達(dá)載體中;通過(guò)電穿孔技術(shù)將hIFN-α基因轉(zhuǎn)染入NKL細(xì)胞中;通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)hIFN-α基因轉(zhuǎn)染后，NKL細(xì)胞IFN-α的mRNA水平，和肝癌細(xì)胞上凋亡相關(guān)分子Fas、Mcl-1、Bcl-xl的表達(dá)水平;通過(guò)RNAi技術(shù)，下調(diào)HepG2細(xì)胞上Fas的表達(dá)水平;通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷相

8、關(guān)分子的mRNA水平;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷相關(guān)分子和HepG2細(xì)胞Fas的蛋白水平;通過(guò)MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞系以及原代肝癌細(xì)胞的殺傷;通過(guò)抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)IFN-γ和TNF-α在NKL-IFNα細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞殺傷過(guò)程中的作用;利用皮下注射和腹腔注射兩種不同荷瘤方式建立裸鼠荷瘤模型，通過(guò)檢測(cè)荷瘤小鼠瘤體積和小鼠生存期來(lái)驗(yàn)證NKL-IFNα細(xì)胞的治療效果。
　　 其次，我們驗(yàn)證了hIL-15基因修飾的N

9、KL細(xì)胞對(duì)肝癌的治療作用，并探討其作用機(jī)制。利用皮下注射和腹腔注射兩種不同荷瘤方式建立裸鼠荷瘤模型，通過(guò)檢測(cè)荷瘤小鼠脾重、肝重、瘤重、脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)和小鼠生存期來(lái)驗(yàn)證NKL-IL15細(xì)胞的治療效果;通過(guò)ELISA檢測(cè)NK細(xì)胞上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷相關(guān)分子NKp80、顆粒酶B、Perforin、TRAIL和HepG2細(xì)胞上NKG2D配體的表達(dá)水平;通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)與NKL-IL15細(xì)胞共培

10、養(yǎng)后，HepG2細(xì)胞的增殖能力;通過(guò)MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性;通過(guò)抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NKG2D、IFN-γ和TNF-α在NKL-IL15細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞殺傷過(guò)程中的作用。
　　 最后，我們探討了hIL-15基因修飾的NKL細(xì)胞對(duì)白血病的治療作用。通過(guò)MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞系以及原代白血病細(xì)胞的殺傷活性;通過(guò)ELISA檢測(cè)NK細(xì)胞上清中IFN-γ和TNF-α的分泌水平;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷相

11、關(guān)分子NKp80、顆粒酶B、Perforin和K562細(xì)胞上NKG2D配體的表達(dá)水平;通過(guò)通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)與NKL-IL15細(xì)胞共培養(yǎng)后，K562細(xì)胞的增殖能力;通過(guò)抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NKG2D、IFN-γ和TNF-α在NKL-IL15細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞殺傷過(guò)程中的作用;利用皮下注射和腹腔注射兩種不同荷瘤方式建立NOD/SCID鼠荷瘤模型，通過(guò)檢測(cè)荷瘤小鼠瘤體積、瘤重和小鼠生存期來(lái)驗(yàn)證NKL-IL15細(xì)胞的治療效果。
　　 結(jié)

12、果：
　　 結(jié)果一:hIFN-α基因修飾NKL細(xì)胞系的建立及其抗肝癌功能與機(jī)制研究
　　 1.構(gòu)建hIFN-α基因修飾的NKL細(xì)胞系我們已經(jīng)成功建立了hIFN-α基因修飾的NKL細(xì)胞系，NKL-IFNα細(xì)胞能夠分泌大量的IFN-α。
　　 2.IFN-α基因修飾能夠增強(qiáng)NKL細(xì)胞對(duì)HCC的殺傷活性NKL-IFNα細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2、H7402細(xì)胞和原代肝癌細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)。特別是，IFN-α基因修飾

13、亦能增強(qiáng)NKL細(xì)胞對(duì)HBV+肝癌腫瘤細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞的殺傷效果。
　　 3.IFN-α基因修飾增強(qiáng)NKL細(xì)胞的活性hIFN-α基因修飾能夠上調(diào)NKL細(xì)胞中殺傷相關(guān)分子TNF-α、IFN-γ、perforin、GranzymeB和FasL的表達(dá)，從而增強(qiáng)NKL細(xì)胞對(duì)HCC的細(xì)胞毒性。
　　 4.NKL-IFNα細(xì)胞誘導(dǎo)的Fas表達(dá)能夠增強(qiáng)對(duì)HCC的殺傷敏感性HCC表面Fas的表達(dá)在NKL-IFNα細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞

14、毒性反應(yīng)中起到主導(dǎo)作用。阻斷HepG2細(xì)胞表面Fas的表達(dá)，會(huì)使NKL-IFNα細(xì)胞所介導(dǎo)的殺傷效果顯著下降。
　　 5.NKL-IFNα細(xì)胞通過(guò)分泌TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)HCC細(xì)胞上Fas的表達(dá)阻斷TNF-α和IFN-γ能夠降低HepG2表面Fas的表達(dá)，進(jìn)而抑制了NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。說(shuō)明，NKL-IFNα細(xì)胞對(duì)HCC的殺傷是Fas依賴的，TNF-α和IFN-γ介導(dǎo)的。
　　 6.IFN-α基因修飾能夠增強(qiáng)

15、NKL細(xì)胞在小鼠體內(nèi)抑制肝癌的效果NKL-IFNα細(xì)胞能夠在腹腔荷瘤和皮下荷瘤小鼠模型中，抑制小鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生存期。
　　 結(jié)果二:hIL-15基因修飾的NKL細(xì)胞系在小鼠體內(nèi)抗HCC作用及機(jī)制研究
　　 1.在小鼠荷瘤模型中，IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞具有顯著抗HCC作用(
　　 )NKL-IL15細(xì)胞治療能夠有效抑制腹腔和皮下荷瘤兩種荷瘤小鼠模型中肝癌細(xì)胞在荷瘤小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠

16、的生存期，發(fā)揮良好的治療效果。
　　 2.IL-15基因修飾能夠增強(qiáng)NKL細(xì)胞對(duì)HCC細(xì)胞的應(yīng)答IL-15基因修飾后的NKL細(xì)胞，對(duì)HepG2細(xì)胞的刺激更加敏感，能夠上調(diào)殺傷相關(guān)分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)對(duì)HCC的殺傷效果。
　　 3.IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞能夠抑制HCC細(xì)胞的增殖IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞能夠通過(guò)分泌細(xì)胞因子，抑制HCC的增殖，增強(qiáng)抗腫瘤功效。
　　 4.IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞通過(guò)

17、分泌TNF-α和IFN-γ上調(diào)HCC細(xì)胞上NKG2D配體的表達(dá)NKL-IL15細(xì)胞通過(guò)分泌TNF-α和IFN-γ上調(diào)HCC細(xì)胞上NKG2D配體的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)HCC對(duì)NK細(xì)胞的殺傷敏感性。
　　 5.NKL-IL15細(xì)胞殺傷功能的增強(qiáng)依賴于NKG2D的識(shí)別和TNF-α的分泌NKG2D的識(shí)別和TNF-α的分泌，在NKL-IL15介導(dǎo)的HCC殺傷過(guò)程中起到非常重要的作用。
　　 結(jié)果三:hIL-15基因修飾NKL細(xì)胞的抗白血

18、病功能及機(jī)制研究
　　 1.hIL-15基因修飾能夠增強(qiáng)NKL細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷功能hIL-15基因修飾能夠增強(qiáng)NKL細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞系和原代白血病細(xì)胞的殺傷功能。
　　 2.IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞能夠抑制白血病細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞上NKG2D配體的表達(dá)IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞能夠通過(guò)分泌細(xì)胞因子抑制白血病細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)，促進(jìn)了NKL細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷。

19、
　　 3.IL-15基因修飾促進(jìn)了NKL細(xì)胞的活化IL-15基因修飾能夠增強(qiáng)NKL細(xì)胞殺傷相關(guān)受體和分子的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)NKL細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷功能。
　　 4.IL-15基因修飾NKL細(xì)胞殺傷功能的增強(qiáng)依賴于NKG2D和IFN-γNKG2D的識(shí)別和IFN-γ的分泌，在NKL-IL15介導(dǎo)的白血病細(xì)胞殺傷過(guò)程中起到非常重要的作用。
　　 5.IL-15基因修飾能夠增強(qiáng)NKL細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果NKL-

20、IL15細(xì)胞能夠抑制小鼠體內(nèi)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生存期。
　　 6.NKL-IL15細(xì)胞能夠活化hPBMC，增強(qiáng)其對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷NKL-IL15細(xì)胞具有對(duì)hPBMC的活化作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.構(gòu)建hIFN-α基因修飾NKL細(xì)胞，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)其對(duì)肝癌的抑制作用，且NKL-IFNα細(xì)胞通過(guò)分泌TNF-α和IFN-γ誘導(dǎo)HCC細(xì)胞上Fas的表達(dá)，依賴Fas/FasL途徑發(fā)揮細(xì)胞毒作用。

21、
　　 2.驗(yàn)證前期構(gòu)建的hIL-15基因修飾的NKL細(xì)胞，在小鼠體內(nèi)對(duì)肝癌的抑制作用，其殺傷作用依賴于NKG2D的識(shí)別和TNF-α的分泌。
　　 3.探討hIL-15基因修飾的NKL細(xì)胞對(duì)白血病的治療作用，初步研究其殺傷機(jī)制是依賴于NKG2D和IFN-γ。
　　 基因修飾的NK細(xì)胞系，可以通過(guò)細(xì)胞因子IL-15和IFN-α的修飾，增強(qiáng)細(xì)胞毒作用，使其適用于腫瘤的過(guò)繼免疫治療?；蛐揎桸K細(xì)胞系的應(yīng)用，能夠?yàn)榧膊?/p>