人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)骨髓瘤KM3細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制探討.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是來(lái)源于終術(shù)分化的B淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤，在造血系統(tǒng)腫瘤中占10％，占全部惡性腫瘤的1％，屬于中老年性疾病。多發(fā)性骨髓瘤以骨髓中漿細(xì)胞的克隆性增生，血清或尿液中出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白或其成分(M蛋白)，正常免疫球蛋白受到抑制以及廣泛溶骨病變和/或骨質(zhì)疏松為特征。多發(fā)性骨髓瘤存在多步驟、多階段的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制，近年主要集中在細(xì)胞遺傳學(xué)異常、骨髓微環(huán)境與骨髓瘤細(xì)胞相互作用、NF-kB及Notc

2、h信號(hào)通路和耐藥機(jī)制幾方面。 造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是造血干/祖細(xì)胞在骨髓定居、增殖、分化、發(fā)育和成熟的場(chǎng)所，是支持和調(diào)節(jié)造血細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的內(nèi)環(huán)境；另一方面，造血微環(huán)境也在血液病的發(fā)生、發(fā)展，血液腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的發(fā)病及瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡與造血微環(huán)境尤為密切。而骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone m

3、arrow stromal cells，BMSCs)作為造血微環(huán)境的主要成份和功能單位，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞的直接粘附和分泌多種細(xì)胞因子影響骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、耐藥和遷移。 150年來(lái)，從馬法蘭的引入到大劑量化療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植，雖使MM治療的有效率和完全緩解率有所提高，但復(fù)發(fā)率仍然很高，目前MM仍是一種不能治愈的疾病。近年隨著基因芯片和蛋白組學(xué)等生物技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們對(duì)MM提出更側(cè)重于微環(huán)境和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的靶向治療。越來(lái)越多的研

4、究表明，通過(guò)改造骨髓瘤細(xì)胞賴以生存的病態(tài)骨髓造血微環(huán)境有利于瘤細(xì)胞的清除。 那么能否采用非骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞替代病態(tài)造血微環(huán)境以促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的清除呢？研究表明，從肝臟、肺臟、胸腺及皮膚等組織來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞尚不能達(dá)到理想的體外HIM模型的功能。我室在前期研究工作中在國(guó)內(nèi)外首先發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了臍血中存在有基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，并經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(human umbilicalcord blood-derived str

5、omal cells，hUCBDSCs)，證明其具備造血基質(zhì)細(xì)胞的基本特征和造血調(diào)控的物質(zhì)基礎(chǔ)，得到了國(guó)際同行認(rèn)可。我們?cè)谇捌谘芯抗ぷ髦袑⑷思毙粤馨图?xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株分別與hUCBDSCs和正常人BMSCs共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hUCBDSCs-HIM具有較hBMSCs-HIM對(duì)Jurkat細(xì)胞更強(qiáng)的抑制增殖作用和促凋亡現(xiàn)象。相比白血病，多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展更依賴于病態(tài)的造血微環(huán)境，那么體外用hUCBDSCs-HIM代替患者的病態(tài)

6、BMSCs-HIM，對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的增殖和凋亡是否會(huì)有類(lèi)似的效應(yīng)呢？ 為了初步探討體外hUCBDSCs-HIM對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用，本課題在構(gòu)建骨髓瘤KM3細(xì)胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)上，體外觀察hUCBDSCs對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞抑制增殖和促凋亡的作用。從IL-6/IL-6R途徑、NF-1(B及其調(diào)控基因途徑兩個(gè)方面深入探討體外hUCBDSCs對(duì)骨髓瘤細(xì)胞抑制增殖和促凋亡的可能機(jī)制，為促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的清除，

7、提供新的輔助治療措施。 方法： 1.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)骨髓瘤KM3細(xì)胞抑制增殖和促凋亡的體外研究 實(shí)驗(yàn)分組：①KM3細(xì)胞懸浮培養(yǎng)組；②KM3細(xì)胞/hUCBDSCs共培養(yǎng)組；③KM3細(xì)胞/MM-BMSCs共培養(yǎng)組。倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察KM3細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的位相關(guān)系；CCK8法繪制KM3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)KM3細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況，透射電鏡觀察KM3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 2.IL-6/IL-6R途

8、徑在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞抑制骨髓瘤KM3細(xì)胞增殖中的作用 ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)前后KM3細(xì)胞、hUCBDSCs和MM-BMSCs培養(yǎng)上清IL-6和sIL-6R濃度；激光共聚焦、流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下KM3細(xì)胞IL-6R蛋白表達(dá)，real time PCR檢測(cè)KM3細(xì)胞IL-6R mRNA表達(dá)水平。 3.NF-kB途徑在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)骨髓瘤KM3細(xì)胞抑制增殖和促凋亡中的作用 3.1人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)骨髓瘤

9、KM3細(xì)胞NF-kB活化的抑制作用 EMSA法、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下KM3細(xì)胞NF-1CB活化情況，Western blot法檢測(cè)KM3細(xì)胞IkBa表達(dá)水平。 3.2人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)骨髓瘤KM3細(xì)胞NF-kB靶基因的抑制作用 流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下KM3細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)，real timePCR檢測(cè)KM3細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)水平。 Wester

10、n blot、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下KM3細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達(dá)，real timePCR檢測(cè)KM3細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.倒置顯微鏡觀察，KM3細(xì)胞呈球形，粘附在hUCBDSCs表面，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，KM3細(xì)胞數(shù)量逐漸增多；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)KM3細(xì)胞可通過(guò)偽足粘附于hUCBDSCs表層，或龕于hUCBDSCs融合所形成的“網(wǎng)眼”中，部分hUCBDSCs胞

11、膜突起與多個(gè)KM3細(xì)胞粘附，形成“放射狀”排列。KM3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示KM3/hUCBDSCs組KM3細(xì)胞增殖最慢；細(xì)胞周期結(jié)果顯示KM3/hUCBDSCs組S期細(xì)胞比例最高，G2/M期比例最低，顯示hUCBDSCs共培養(yǎng)組KM3細(xì)胞阻滯于S期。凋亡率結(jié)果顯示KM3/hUCBDSCs組KM3細(xì)胞凋亡率最高，死亡率無(wú)顯著差異。 2.IL-6/IL-6R途徑在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞抑制骨髓瘤KM3細(xì)胞增殖的中的作用 ELISA檢

12、測(cè)結(jié)果顯示hUCBDSCs也分泌IL-6，并且共培養(yǎng)后KM3細(xì)胞可以刺激hUCBDSCs分泌IL-6；但無(wú)論是共培養(yǎng)前還是共培養(yǎng)后IL-6的表達(dá)水平均明顯低于MM-BMSCs分泌IL-6水平。ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)前后KM3細(xì)胞分泌sIL-6R的水平，顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細(xì)胞分泌sIL-6R的水平下降地更明顯；流式細(xì)胞儀檢測(cè)也顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細(xì)胞mIL-6R表達(dá)的陽(yáng)性率下降得更明顯；real time

13、 PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下KM3細(xì)胞IL-6R mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細(xì)胞IL-6R mRNA表達(dá)最低。 3.NF-kB途徑在人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)骨髓瘤KM3細(xì)胞抑制增殖和促凋亡中的作用 3.1 EMSA法和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細(xì)胞NF-kB的活性最低，NF-kB在部分KM3細(xì)胞胞漿高表達(dá)、胞核不表達(dá)或低表達(dá)；Westernblot檢測(cè)顯示hUCB

14、DSCs共培養(yǎng)組KM3細(xì)胞IkBa蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)。 3.2流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)的KM3細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)平均熒光強(qiáng)度明顯減弱，MM-BMSCs共培養(yǎng)組KM3細(xì)胞ICAM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，且可在部分KM3細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)紅色點(diǎn)狀熒光：real time PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下KM3細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)情況，與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)最低

15、。 Western blot和激光共聚焦顯檢鏡檢測(cè)顯示與hUCBDSCs共培養(yǎng)的KM3細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)明顯減弱，MM-BMSCs共培養(yǎng)組KM3細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)明顯增強(qiáng)；real time PCR檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下KM3細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表達(dá)情況，與hUCBDSCs共培養(yǎng)后KM3細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL mRNA表達(dá)最低。 結(jié)論： 1.人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)骨髓

16、瘤KM3細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用：①生長(zhǎng)曲線——細(xì)胞擴(kuò)增速度受抑；②細(xì)胞周期--S期細(xì)胞比例明顯增多，但G2/M期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞周期阻滯于S期；③掃描電鏡——可見(jiàn)KM3通過(guò)偽足粘附、龕合于hUCBDSCs細(xì)胞：④凋亡率：凋亡率增加；透射電鏡——可見(jiàn)凋亡和死亡細(xì)胞。 2.hUCBDSCs可以分泌IL-6并且骨髓瘤KM3細(xì)胞也可促進(jìn)其分泌IL-6：hUCBDSCs構(gòu)成的新型造血微環(huán)境IL-6的表達(dá)水平顯著低于MM-BMSC